1-7) داروهای ترومبولیتیک 17
1-8)جنبه های اقتصادی 18
1-9) تاریخچه داروهای ترومبولیتیک 18
1-10)روش های مقابله با ترومبوآمبولی 19
1-11)تجزیه لخته های فیبرینی 20
1-12)مهار کننده های t-PA 20
1-12-1) 2 α آنتی پلاسمین 21
1-12-2) 2 α ماکروگلوبین 21
1-12-3) TAF-I)) Thrombin Activable Fibrinogen Inhibitor 21
1-13)سنتز t-PA 22
1-14)میل الحاقی به فیبرین 22
1-15)غلظت-فعالیت و نیمه عمر 22
1-16)ساختار دومن ها 23
1-17)تاریخچه درمان تجزیه لخته 24
1-18)داروهای تجزیه کننده فیبرین 24
1-19)طبقه‌بندي داروهاي ترومبوليتيک 24
1-20)انواع فعال کننده های پلاسمینوژن 25
1-20-1) Streptokinase 27
1-20-2) Urokinase 27
1-20-3) Staphylokinase 28
1-20-4) Alteplase 28
1-20-5) Reteplase 29
1-20-6) Tenecteplase 30
1-20-7) Lanoteplase 30
1-21) Truncated t-PA 30
1-20-8) میزبان های رایج در تولید پروتئین های نوترکیب 32
1-21)انتخاب رده سلولی مناسب 33
1-22)رده های سلولی رایج در بیان پروتئین های نوترکیب 34
1-23)مزایای CHO 34
1-24)روش های بیان ژن 34
1-24-1)سیستم بیان پایدار ژن Transient Gene Expression)) 34
1-24-2)سیستم بیان موقت ژن Transient gene expression)) 34
1-25)روش های انتقال ژن به سلول های پستانداران 36
1-25-1)روشهای انتقال ژن غیر ویروسی 36
1-26)فاکتور های دخیل در کشت سلول های نوترکیب 37
1-27)انواع سلول ها از نظر نحوه کشت 37
1-27-1)سلول های غیر وابسته به بستر 37
1-27-2)سلول‌های وابسته به بستر 38
1-28) کشت معلق 38
1-29)انتخاب محیط کشت مناسب و شرایط محیط کشت 39
1-30)بهینه سازی شرایط کشت سلول 39
1-31)متابولیسم سلولی و تولید متابولیت های سلولی 39
1-31-1)نقش گلوکز در محیط کشت 40
1-32)عناصر تشکیل دهنده محیط کشت 41
1-32-1)عناصر ماکرو 42
1-32-2)عناصر میکرو 42
1-32-3)نقش عناصر میکرو در محیط کشت 42
1-32-4)ویتامین ها 43
1-32-5) Pluronic acid 43
1-33)نقش گلوتامین در محیط کشت 44
مواد و روش ها 46
2-1)دستگاه های مورد نیاز 47
2-2) میکروارگانیسم ها و سلول های مورد استفاده 47
2-3)لیست کامل مواد استفاده شده 48
2-4) لیست کامل وسایل مورد استفاده 50
2-5) شرایط لازم جهت انجام کشت سلول rCHO DG44 50
2-5-1)محیط های کشت جهت فرایند بهینه سازی 51
2-5-1-1)تهیه محیط کشت BRC 51
2-5-1-2)ذخیره سازی سلول ها و محیط های کشت 51
2-6)آماده سازی سلول هایrCHO DG44 52
2-7) دفریز نمودن سلولهایrCHO DG44 52
2-8) انکوباسیون سلول هایrCHO DG44 53
2-8-1)انكوباتور دي اكسيد كربن 53
2-8-2)دمای انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44 53
2-8-3) میزان co2 انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44 54
2-8-4) رطوبت انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44 54
2-9) استریلیزاسیون انکوباتور 54
2-10) آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها 55
2-10-1) میزان مصرف آنتی بیوتیک 55
2-11) کشت سلول های rCHO DG44 56
2-12)ارزیابی وضعیت محیط کشت از نظر pH 56
2-13) شمارش سلول های rCHO DG44 57
2-13-1)اصول شمارش سلول 57
2-13-2)تعیین درصد سلول های زنده Viability)) 59
2-13-3) انجماد سلولها و ذخیره سازی آنها Cell Freezing)) 59
2-14)ترانسفکشن سلول rCHO DG44 60
2-14-1)پلاسمید حاوی ژن 60
2-14-2)تهیه DNA‌ 60
2-14-3)کشت سلول 61
2-15)بهینه سازی فرایند TGE 61
2-15-1)ترانسفکشن به روش PEI 61
2-15-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE 61
2-15-3)بررسی میزان بهینه DNA جهت انجام TGE 62
2-15-4)اندازه گیری میزان درصد ترانسفکشن 62
2-15-4-1)اندازه گیری GFP به روش فلوسایتومتری 62
2-16)افزودن غلظت های متفاوت پپتون های گیاهی به محیط های کشت 62
2-16-1) تعیین پروفایل رشد 70
2-16-2)تعیین پروفایل بیان به روش Elisa 70
2-16-2) بررسی تغییرات رفتار متابولیک سلول ها 72
نتایج 76
3-1)ترانسفکشن سلول های rCHO DG44 به روش TGE 76
3-1-1)بررسی میزان بهینه PEI جهت انجام TGE 76
3-1-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE 83
3-1-3)بررسی میزان بهینه DNAجهت انجام TGE 96
3-2)تعیین الگوی رشد سلول های CH0 DG44 در محیط های کشت ProCHO 5,CD DG44و BRC 109
3-3)غلظت پپتون ها وابسته به نوع محیط کشت 110
3-4)بررسی تغییرات متابولیکی در سلول های CHO DG44 تولید کننده t-PA 115
3-4-1)بررسی تغییرات متابولیکی در محیط ProCHO 5 115
3-4-2)تغییرات متابولیکی در محیط CD DG44 117
3-4-3) بررسی تغییرات متابولیکی در محیط BRC CD 118
3-5)بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان بیان پروتئین نوترکیب 119
3-6)بررسی تاثیر استراتژی تغذیه با پپتون های گیاهی در بهینه سازی TGE 121
بحث و نتیجه گیری نهایی 129
منابع 133
اختصارات 136
Optimization of recombinant protein production in TGE system 137
Abstract 137
چکیده
بیماری عروق کرونر قلب یکی از شایع ترین بیماری ها در سطح جهان به خصوص کشور های صنعتی می باشد.
فعال‌کننده پلاسمينوژن بافتي (t-PA( Tissue Plasminogen Activator، يک پپتيد طبيعي است که با اتصال به فيبرين موجود در لخته و تبدیل پلاسمینوژن به پلاسمین باعث شکسته شدن فيبرين، فيبرينوژن و ساير پروتئين‌هاي انعقادي شده و با رفع انسداد باعث به حداقل رساندن آسيب بافتي و در نهايت نجات بيمار مي‌شود. پروتئین مورد بررسی در این مطالعه فرم کوتاه شده موتانت از داروی t-PA باخواص فارماکولوژیک بهینه می باشد که در میزبان بیانی CHO(Chinese Hamster Ovary) با هدف تغییرات پس ترجمه ای مناسب و مشابه فرم طبیعی بیان می شود.
بیان موقت پروتئین(Transient Gene Expression) TGE روش رایجی برای بیان پروتئین های نو ترکیب در بازه زمانی کوتاه و در مقیاس مناسب جهت انجام تست های پیش بالینی Preclinical)) می باشد.در این مطالعه از این روش و بهینه سازی آن برای تولید پروتئین نوترکیب t-PA استفاده شد و مقادیر بهینه شده برای میزان cell DNA106/µg2 وبرای عامل انتقال ژن Transfection reagent)) cell 106/µg5/1 و میزان سلول مورد استفاده 105×5 سلول معین گردید.همچنین با دیدگاه Scale-up در بیوپروسه و اثر استراتژی های تغذیه ای با عوامل پپتونی مختلف بر میزان بیان و رشد پروتئین و تغییر رفتار متابولیک آن بررسی گردید.به منظور بهینه سازی بیان فعال‌کننده پلاسمينوژن بافتي (t-PA)در سلول CHO در این فرایند از 6 پپتون با منشا گیاهی(Soy,Casein) مختلف استفاده گردید .آنالیز نتایج نشان داد که چگونگی تاثیر پپتون ها بر روی بیان ژن مورد نظر در سلول CHO در تعدادی از پپتون ها از الگوی خاصی تبعیت می کند.در برخی موارد اثر مثبت و در موارد خاصی تاثیر منفی داشته است , که احتمالا این تاثیرات ناشی از ماهیت ترکیب آمینو اسیدی پپتون های به کار رفته می باشد. همچنین استفاده از این ترکیبات پپتونی در محیط کشت سلول ترانسفکت شده علاوه بر افزایش بیان پروتئین می تواند سبب کاهش تولید متابولیت های نامطلوب نیز شود.
واژه های کلیدی: سلول CHO , t-PA , فیبرینولیز ,فیبرینوژن
مقدمه
1-1)اهمیت پروئینهای نوترکیب – جایگاه جهانی و درمانی
پروتئین ها ماکرومولکولهایی هستند که در هرجایی از سلولها جای می گیرند.آنها در رشد سلولی، متابولیسم، سازماندهی، انتقال و جهش نقش دارند. در ارگانیسم های چندسلولی، پروتئین ها سیستم ایمنی، سیگنال بندی عصب، رشد و تقسیم کل ارگانیسم را کنترل می کنند.جهش یا رونویسی غیرعادی پروتئین ها می تواند منشاء بیماریهای بسیاری شود. با توجه به اینکه ژنوم انسان حاوی بیش از 30.000 ژن است و اینکه تعداد پروتئین هایی که تولید می شوند حتی بیشتر از این مقدار هستند،فرصت هایی برای شرکت های داروسازی به دست آمده تا داروهای جدیدی را توسعه دهند که بسیار فراوان هستند. بنابراین در طول دهه های گذشته،پروتئین ها به اهدافی برای توسعه درمانهای جدید تبدیل شدند. وقتی که پروتئین ها اولین بار به عنوان موارد درمانی مورد استفاده قرار گرفتند، از منابع انسانی و حیوانی خالص سازی شدند. نمونه هایی از این قبیل شامل هورمون رشد انسان از جسد انسان، انسولین از گاو یا خوک و هورمون تحریک کننده غدد ترشحی انسان از اوره می شدند. به هر حال استفاده از این منابع با نگرانی هایی هم همراه بود.خوشبختانه امروزه محصولات منابع حیوانی کمتر به کار می روند. در واقع از اواخر دهه 1970، رشد در بیوتکنولوژی امکان تولید پروتئین از “DNA دارای صفات ارثی” با استفاده از سیستم های میزبان پروکاریوتی یا یوکاریوتی را فراهم کرده است.این پروتئین ها ، دارای صفات ارثی هستند و از پروتئین های داخلی قابل تمایز هستند، آنها بواسطه رونویسی ژنهایی که دارای صفات ارثی جدید هستند، تولید می شوند. اولین پروتئین نوترکیب، که برای انسان به کار رفت انسولین بود که در E.coli توسط Eli Lili در سال 1984 تولید شد. اولین پروتئین نوترکیب تولید شده در میزبان یوکاریوتی ، فعال کننده پلاسمینوژن بافتی t-PA از سلولهای تخمدان هامستر چینی CHO2 بود که در سال 1986 تولید شد. در سال 2007، بیش از 170 محصول بیودارویی وجود داشت که توسط انجمن دارو و غذا FDA در ایالات متحده تائید شد، اما انتظار می رفت که در سالهای آتی این مقدار افزایش یابد، در سال 2006، حدود 5.000 محصول پروتئینی در آزمایشات اکتشافی و بالینی و پیش بالینی گزارش شد.در میان سیستم های رونویسی کننده میزبان، آنچه که بسیار کاربرد داشت سلولهای کشت شده پستانداران و E.coli بود. حدود نیمی از محصولات پروتئینی درمانی در بازار از سلولهای پستانداران تولید می شد. حتی اگر بافت سلول پستانداران پیچیده و پرهزینه تری نسبت به کشت میکروبی بود باز این سلولها ارجحیت داشتند زیرا سلولهای پستانداران قادر به اصلاح پروتئین ها بعد از PTM (Post Translational Modification) ، و بخصوص گلیکوزیلاسیون بودند.میزبانهای دیگر قادر گلیکوزیلدار کردن پروتئین ها بودند مثل مخمر و سلولهای گیاهان و حشرات کشت شده. این فرایند در این میزبان ها نسبت به آنچه که در سلولهای پستانداران دیده شد، متفاوت بود.اما تلاشها همچنان ادامه داشت تا گلیکوزیلاسیون در این میزبانهای غیر پستاندار هم به شکل پستانداران هدایت شود. در سال 2007، FDA اولین بیودارویی که در سلولهای حشرات برای کاربریهای انسانی تولید شده بود، تائید کرد.میزبانهای جایگزین شامل حیوانات و گیاهان ترنس ژنیک می شدند اما اینها هنوز در مرحله توسعه قرار داشتند.
در سال 1973 Staley Cohenو Herbert Boyer به عنوان پیشگام در استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب برای کلونینگ و بیان ژن خارجی در موجودات شناخته شدند.
تولید اولین پروتئین نوترکیب انسانی چند سال بعد از، زمانی که شرکت زیست فناوری Genetchبیان ژن سوماتوستاتین انسانی را در E. coli را اعلام کرد گزارش شد. میزان فعالیت هورمون به دست امده معادل استخراج سوماتوستاتین از مغز 500.000 راس گوسفند بود. به دنبال این موفقیت در سال 1982 Genetch با humulin ، که انسولین نوترکیب به دست امده از E.coli بود را به عنوان اولین نوترکیب داروی زیست فناوری پذیرفته شده توسط غذا و داروی آمریکا (FDA) را به بازار عرضه کرد.
آنها DNA پلاسمید RSF1010 استرپتومایسین مقاومت از سالمونلا تیفی موریوم را به پلاسمید به pSC101 اشرشیاکلی را کلون نمودند و وجود مقاومت به استرپتومایسین در سلولهای ترانسفورم شده را مشاهده کردند.
ساخت پروتئین نوترکیب یک مرحله چالش برانگیز درفرآیند کشف و تولید دارو می

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید