مانند هيپوكلريت ها مثل آب كلره و آب ژاول یا الكل ها مثل اتانول و ايزوپروپانول و همچنین آلدئيدها مثل فرمالدئيد و گلوتارآلدئيد در اتاق کشت استفاده می شود.
2-5-1)محیط های کشت جهت فرایند بهینه سازی
➢ محیط های کشتی که مورد استفاده قرار می گیرند به دو صورت آماده و با ترکیبات تقریبا نامشخص و محیط های کشت ساختنی که ترکیبات آنها مشخص است تقسیم می شوند.
محیط های کشت CD DG44و ProCHO 5 به صورت آماده به ترتیب از شرکت های (Lonza,Gibco) تهیه می شوند.محیط کشت BRC توسط بخش بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران طراحی و تهیه شده و ترکیبات آن مشخص می باشد.
2-5-1-1)تهیه محیط کشت BRC
برای آماده سازی محیط های کشت ساختنی تهیه یک آب دوبار تقطیر شده یا اسمز معکوس ضروری است.
➢ برای تهیه محیط کشت BRCآب دوبار تقطیر شده اتوکلاو شده درº121 سانتی گراد به مدت 20 دقیقه با pH تنظیم شده مورد استفاده قرار می گیرد.
➢ پس از تهیه محیط کشت باید استریلیزاسیون آن به دقت انجام پذیرد. محیط های کشت مورد استفاده به دلیل دارا بودن آنزیم ها, هورمون ها, کوفاکتور ها و بافر های بی کربنات قابلیت اتوکلاو نداشته و به واسطه عبور از یک فیلتر غشایی یک بار مصرف با قطر منافذ 2/0 میکرومتر و با کمک پمپ خلا جهت تسریع در مکش محیط کشت و جلوگیری از آلودگی احتمالی استریل شدند.جهت اندازه گیری دقیق محلول های مورد نیاز از میکروپیپت های یک بار مصرف دقیق استفاده شد.
2-5-1-2)ذخیره سازی سلول ها و محیط های کشت
پس از تهیه و آماده سازی ,ذخیره سازی محیط های کشت مایع در º4 سانتی گراد و ترکیباتی مانند آنزیم ها و برخی دیگر از محتویات محیط کشت مانند گلوتامین و FBS در 20- درجه امری بسیار مهم و ضروری می باشد. لازم به ذکر است که سلول ها برای ذخیره و نگهداری به نیتروژن مایع یا فریزر 70- درجه سانتیگراد نیاز دارند.
2-6)آماده سازی سلول هایrCHO DG44
بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان رشد و بیان پروتئین نوترکیب در سلولهای ترانسفکت شده CHO و همچنین انجام TGE نیاز به سلولهای آداپته شده با محیط کشت های مورد نظر می باشد.
➢ قبل از کار با هود باید چراغ uv آن به مدت min15 روشن شود تا محیط داخل هود و وسایل آن کاملا استریل شودن.پس از خاموش کردن لازم استmin 5 صبر نمود و سپس کار را شروع کرد.
➢ سلولهای فریز شده در تانک ازت یا فریزرº70- پس از خروج از تانک ازت باید به سرعت آنها را دفریز شوند.
➢ از آنجایئکه مهمترين اصل در رابطه با انجماد سلولي، منجمد كردن تدریجی و ذوب كردن سريع سلول هاست , زمان ذوب شدن نبايد بيش از 3 تا 5 دقيقه طول بكشد. اين زمان ها در رابطه با رده های سلولي مختلف تا حدودي متفاوت است. اما بطور كلي سلول ها بايستي با سرعت حدود º1- تا º3- سانتيگراد در هر دقيقه منجمد شده و با قرار گرفتن در بن ماريº 37 سانتيگراد سريعاً ذوب شوند.
2-7) دفریز نمودن سلولهایrCHO DG44
1- محیط کشت مورد نظر تا دمای º37 سانتی گراد گرم شد.
2- ویال حاوی سلولهای منجمد از مخزن ازت خارج شده و در ظرفی درون آب º37 سانتی گراد شناور گردید.
3- وقتی که محتویات ویال ذوب شد، درپوش آن را با الکل اتانول 70% استریل و باز شد.
4- محتویات ویال های حاوی سلولها ی CHO DG44 به فالکون های استریل منتقل شد.
5- به اندازه 2 برابر حجم سلولها محیط کشت گرم به آرامی به آنها اضافه گردید.
6-سپس در سانتریفوژ با دور rpm1100 به مدت 5 دقیقه در دمای º18 سانتی گراد سانتریفوژ نموده تا پلت سلولی حاصل شد.
7-مایع رویی به دقت خارج گردیده زیرا این مایع حاوی DMSO می باشد که برای سلول سمی می باشد و باید به سرعت از سلول ها جدا شود.
8- کمی محیط کشت به فالکون اضافه نموده و با پیپت پاستور استریل سلول ها به خوبی سلولها یکنواخت شدند.
9- سلولها برای رشد در غلظت مناسب کشت داده شدند.
2-8) انکوباسیون سلول هایrCHO DG44
آزمایشگاه کشت سلول به یک انکوباتور برای نگهداری سلول ها در دمای °30 تا °40 سانتی گراد نیاز دارد. دمای انکوباسیون به نوع سلول های کشت شده بستگی دارد. دمای انکوباسیون سلول های مورد نظر °37 سانتی گراد می باشد.
2-8-1)انكوباتور دي اكسيد كربن
هنگام کار با عوامل بیولوژیک مانند رده های مختلف سلولی همچنین رده سلولی CHO DG44 عـلاوه بـر كـنـتـرل دمـا  تـامـين درصد خاصي از دي اكسيد كربن (مثلا 5)% داخل محفظه انـكـوبـاتـور مورد نیاز است. گـاز 2 CO از سـيـلـنــدر گــازي كــه حــاوي ايــن گـاز اسـت به داخل انکوباتور تزریق می شود.غـلـطـت 2 CO يـا با سنسورهاي رساناي گــرمــايــي(TCD‌) يـا بـا سـنـسـور هـاي مـادون قـرمـز (infra-red) کنترل مـي شود. در موارد خاصی رطوبت بسيار بالا درون محفظه مورد نیاز است كه با استفاده از حمام هاي آبي و تبخير مداوم آب ایجاد می شود.
شکل ( 2-1)
2-8-2)دمای انکوباتور جهت کشت سلول rCHODG44
بیشتر لاین های سلولی و سلول های پستانداران مانند CHO DG44در دمایº5/36 سانتیگراد نگهداری می شوند. انکوباتورها به گونه ای طراحی شده اند که یک درجه حرارت یکنواخت را تنظیم کنند.
استفاده از انکوباتورمجهز به سیستم گردش هوا به یکنواختی هوا در انکوباتور کمک نموده و آن را حفظ می نماید.جهت انکوباسیون سلول ها دمای انکوباتور در° 37 سانتی گراد ثابت شد و درجه حرارت طوری طوری تنظیم شد که نهایتاً 5/0± درجه سانتیگراد در هر دمایی که تنظیم شده است تغییر کند.
2-8-3) میزان co2 انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44
به طور کلی، رده های سلولی بسیاری قادرند در اتمسفری حاوی 95% هوا و 5% 2 CO و با رطوبت نسبی 99% قابلیت زنده ماندن خود را حفظ نمایند. 2CO در کشت سلول وظیفه تنظیم pH محیط کشت را دارد. غلظت 2CO باید در تعادل با کربنات سدیم محیط کشت باشد. از آنجائیکه محیط های کشت مختلف ظرفیت بافری متفاوتی دارند انکوباتور مورد استفاده باید برای فراهم کردن 2 COاز یک منبع اصلی یا سیلندر گاز استفاده کند چرا که هوای درون انکوباتور باید همیشه بین 2 الی 5% 2 CO داشته باشد.
• جهت جلوگیری از خروج 2CO و کاهش حرارت دفعات باز و بسته کردن در انکوباتور باید به حداقل برسد.
• اگر غلظت 2 CO کاهش یابد، آلارم انکوباتور فعال می شود.
2-8-4) رطوبت انکوباتور جهت کشت سلول rCHO DG44
• آشکارساز های میزان 2 CO در انکوباتور فقط در هوای مرطوب به درستی عمل می نمایند.
• آب در مخزن استیل درون انکوباتور از تبخیر وخشک شدن محیط کشت جلوگیری می کند . جهت پر نمودن مخزن علاوه بر آب مقطر استریل از محلول سولفات مس 1% یا ساولن اتوکلاو شده نیز استفاده و هفته ای یک بار تعویض می شود.این مواد ضمن تامین رطوبت مورد نیاز در انکوباتور با ایجاد بخارات ضد عفونی کننده اثر ضد قارچی نیز دارند.
2-9) استریلیزاسیون انکوباتور
➢ براي تميز كـردن انـكـوبـاتـور بـهـتـريـن مـاده الـكـل 70 % اسـت. هـنـگـام تـمـيـز كـردن باید از ريـخـتـن آب، يـا اسـتـفاده از محلول سديم كلرايد يا محلول هاي هالوژن دار كه بـاعـث خـوردگـي رنـگ مـي شـوند و يا محلول هاي قـلـيـائـي يـا اسـيـدي قـوي خـودداري شود. هـنـگـام استفاده از الكل براي تميز كردن داخل انكوباتور به ويژه اگر انكوباتور با درجه حرارت هاي بالا تميز شود بايد دقت بالايي داشت چراكه در اين شرايط الكل تبخير شده و تمام فضاي داخل انكوباتور را فــرا مــي‌گـيــرد و امـكـان خـطـر انـفـجـار وجـود دارد بـنـابـرايـن بـايد تمام الكل باقي مانده به خوبي پاك شود.
➢ از باز گذاشتن در انکوباتور هنگام انتقال سلول ها به هودلامینار باید خودداری شود زیرا این امر سبب آلودگی انکوباتور و خارج شدن 2 CO و پائین آمدن دمای انکوباتور می شود.
➢ براي برداشتن فلاسك هاي كشت سلول و پليت باكتري ها حتما از دستكش‌هاي لاتكس ضد عـفـــونـــي شـــده اسـتـفــاده شــود.
➢ در صــورت ديــدن آلـودگـي در فـلاسـك هـاي كـشـت بـلافـاصله تمام كـشـت‌هـا را خـارج كـرده و داخـل انـكـوبـاتـور ا بـه خوبي با الكل 70 % ضد عفوني نمود, مي توان براي اسـتريل كردن قفسه‌ها آن ها را در داخل فور قرار داد.
➢ قـفـسـه هـا و ديـواره هاي دستگاه همواره بايد خـشـك بـاشـد و از بـاز مـانـدن درب دسـتـگـاه براي مـدت طـولانـي پرهيز شود چراكه در اين صورت رطـوبـت مـوجود در انكوباتور به صورت قطرات آب در آمده و محيط مناسبي براي رشد باكتري ها، قارچ ها و مخمرها ايجاد مي شود.
2-10) آنتی بیوتیک ها و آنتی مایکوتیک ها
از آنجائیکه رشد سلول‌های جانوری بسیار کند تر از رشد باکتری‌ها و مخمرها می باشد و امکان آلودگی وجود دارد برای جلوگیری از رشد باکتری‌ها گاهی از آنتی بیوتیک هایی مانند : پنی سیلین، استرپتومایسین و یا جنتامایسین استفاده می‌شود.رایج ترین آنتی بیوتیک مورد استفاده پن/استرپ ( Pen/Strep ) می باشد.
2-10-1) میزان مصرف آنتی بیوتیک
پن استرپ X100 که در ویال های 1 میلی لیتری در فریزر 20- درجه نگهداری می شود هنگام استفاده باید در دمای° 37 ذوب و به نسبت 1 درصد به محیط کشت اضافه شود.
آنتی بیوتیک پن استرپ دارای اجزای زیر می باشد:
دارو
هدف دارو
غلظت در بسته بندی
غلظت مورد نیاز
نحوه عمل
پنی سیلین جی
باکتری گرم مثبت
10000 واحد در میلی لیتر
100 واحد در میلی لیتر
مهار تولید دیواره سلولی
استرپتو مایسین
باکتری گرم منفی
100 میلی گرم در میلی لیتر
100 میکروگرم در میلی لیتر
مهار ترجمه زیر واحد 30S ریبوزوم
آمفوترایسین بی
قارچ/مخمر
250 میکروگرم در میلی لیتر 
5/2 میکروگرم در میلی لیتر 
تغییر در نفوذ پذیری غشاء
جدول (2-1)
2-11) کشت سلول های rCHO DG44
➢ به دلیل معلق بودن سلول های CHO DG44 می توان از فالکون یا فلاسک جهت کشت آنها استفاده نمود. با استفاده از منحنی رشد سلول ها می توان به مدت زمان لازم جهت رسیدن آنها به فاز Log رشد پی برد .بهترین بازه زمانی جهت تعویض محیط کشت سلول CHO DG44 ترانسفکت شده مورد بررسی 3 روز می باشد. به این ترتیب که طی مدت 3 روز می توان بدون تعویض محیط کشت درصد سلول های زنده را در حدود90% نگه داشت.
به دلیل نیازمند بودن سلول ها به گاز 2 CO در فلاسک های حاوی سلول در داخل انکوباتور به گونه ای بسته می شود که ورود و خروج هوا امکان پذیر باشد.
➢ در مراحل اولیه کشت و پس از دفریز نمودن سلول ها به دلیل وجود آداپته نبودن سلول ها به شرایط جدید ممکن ات طی چند روز اول شمار سلول های مرده افزایش یابد که برای مرتفع کردن این مشکل هر روز محیط کشت سلول ها را تعویض نموده تا به این ترتیب طی فرایند سانتریفوژ بخشی از سلول های مرده که در لایه رویی حاصل از سانتریفوژ قرار می گیرند از محیط خارج شوند.
➢ بهتر است سلول ها در محیط هایی با فضای کوچک مانند پلیت های 6 یا 12 خانه ای که امکان ایجاد سطح تماس بالا و افزایش رشد سلول ها را فراهم می کنند کشت شوند.پس از افزایش شمار سلول ها انتقال آنها به فضای بزرگتر امری ضروری است زیرا تراکم بالا سبب ایجاد ممانعت فضایی و مرگ آنها می گردد.
➢ پس از 24 ساعت از انکوباسیون ردیابی رشد سلولها انجام می گیرد.
2-12)کنترل وضعیت محیط کشت از نظر pH
➢ اغلب سلول ها در محدوده 4/7: pH به خوبی رشد می کنند.  تغییر رنگ محیط در طول کشت به عنوان یک نشانگر pH عمل می نماید.
رنگ محیط کشت در pH های مختلف
7.8
7.6
7.4
7.0
6.5
کمتر از 6.5
pH
ارغوانی
صورتی
قرمز
نارنجی
زرد
لیمویی
رنگ
جدول(2-2)
➢ چنانچه رنگ محیط کشت به زرد تغییر رنگ دهد می تواند به دلیل یکی از این عوامل باشد:
1- رشد

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید