(Transient Gene Expression )یا بیان موقت ژن است [27].
با استفاده از عوامل انتقال ژن کم هزینه مانند: کلسیم فسفات و پلی اتیلن ایمین (PEI) ، کشت معلق از سلولهای پستانداران در حجمهای 1 میلی لیتر تا 100 لیتر به روش TGE برای بیان پروتئین تا مقادیر mg/L در بازه زمانی 10-5 روز پس از Transfection مورد استفاده قرار گرفته است .
روش TGE نیاز به ورود پایدار ژن به ژنوم ندارد.پس از ورود DNA به هسته مراحل رونویسی و ترجمه شروع شده و چند ساعت پس از انتقال ژن پروتئین مورد نظر قابل ردیابی خواهد بود.
در ابتدا تکنیک TGE برای سلولهای چسبنده بکار گرفته می شد; اما نیاز به تولید بیشتر توسعه TGE در سیستمهای معلق در مقیاس بالا را ضروری نمود. روشهای ترانسفکشن ویروسی و غیر ویروسی زیادی برای سلولهای معلق بهینه سازی شده اند که در این طرح تنها بر روشهای غیر ویروسی تاکید می گردد.
1-25)روش های انتقال ژن به سلول های پستانداران
با استفاده از دو روش ویروسی و غیر ویروسی می توان ژن ها را به سلول های پستانداران انتقال داد.
در میزان بیان در روش نسبتاً کم هزینه TGE و تعیین محدودیتهای روش TGE برای رسیدن به میزان های بالاتر بیان در سلولهای CHO-DG44 و یافتن راه حلهای مناسب برای رفع محدودیتها مورد نظر می باشد.
ایجاد ساختارمناسب بیان موقت TGE)) در سیستم Shaker Incubator به عنوان زیرساخت برای تولید انواع پروتئینهای نوترکیب در مقیاس مناسب جهت ارزیابی های پیش- بالینی ((Pre-clinical در بخش بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران محسوب می شود.
امروزه نیاز به پروتئینهای نوترکیب در تحقیقات پایه و کاربردهای بالینی رشد روز افزونی از خود نشان می دهد. لازمه بیان پروتئین های نوترکیب،وارد سازی DNA خارجی به سلول میزبان،طی پروسه ترانسفورماسیون (برای سلولهای پروکاریوتی) و ترانسفکشن (برای سلولهای یوکاریوتی)است. با وجود امکان بیان در انواع میزبانها، کشت سلولهای پستانداران غالباً نخستین انتخاب در زمانی است که تاخوردگی و تغییرات پس ترجمه ای مناسب برای فعالیت پروتئین ضروری است. تقریباً 300 آنتی بادی مونوکلونال و 440 پروتئین نوترکیب بین سالهای 1980 تا 2004 وارد فاز مطالعات بالینی گشتند. در حالیکه 130 مونوکلونال آنتی بادی و 140 پروتئین نوترکیب تحت مطالعات انسانی قرار داشتند. در سال 2007، بیشتر از 170 محصول بیودارویی تائید شده از U.S.FDA وجود داشت.
بطور کلی با وجودیکه این دیدگاه، روش استاندارد برای تولید پروتئینهای نوترکیب در مقیاس بازار است، تولید پروتئینهای نوترکیب در سلولهای پستانداران به روش انتقال ژن و بیان موقت نیز امکان تولید مقادیر میلی گرم تا گرم از پروتئین را در بازه زمانی کوتاه ( چند روز تا چند هفته) با مقیاس تا حدود 100 لیتر را ایجاد می کند. بطوریکه در آینده پروتئینهای تولید شده در این سیستم ممکن است قادر به کسب تائیدیه های نظارتی برای ورود به بازار شوند.
1-25-1)روشهای انتقال ژن غیر ویروسی
روش های غیر ویروسی شامل روش های شیمیایی و فیزیکی می باشد
قدرت تغییر در اندازه و تعداد ژن مورد انتقال و نیز نبود مسائل biosafety از مزایای روشهای غیر ویروسی (non-viral ) انتقال ژن به سلولهای پستانداران،نسبت به روشهای ویروسی سلولها, می باشند. بطور کلی روشهای غیر ویروسی به دو دسته مکانیکی ( میکرو اینجکشن و الکترو پوریشن) و غیر مکانیکی (رسوب کلسیم فسفات- DNA ، لیپوفکشن و پلی فکشن) تقسیم بندی می شوند. اساس روشهای غیر مکانیکی ایجاد نانو پارتیکل هایی با شارژ مثبت، در اتصال به DNA با شارژ منفی می باشد. این ذرات قابلیت ورود به سلول را خواهند داشت. روش رسوب همزمان با کلسیم فسفات، DNA را با کلسیم،رسوب می دهد در حالیکه لیپوفکشن و پلی فکشن اتصال بین DNA و به ترتیب لیپوزیوم (Lipoplex)و پلیمرهای کاتیونی (Polyplex) ایجاد می کند.
با توجه به رده سلولی و کاربری مورد نظر روش ترانسفکشن، ،انتخاب می گردد. روشهای جدید زیادی مانند لیپیدهای کاتیونی، پلیمرهای کاتیونی، با هدف بهینه سازی کارآمدی Transfection مورد بررسی قرار گرفته اند. هدف این روشها بطور کلی،ایجاد پارتیکل های تجمع یافته تر از DNA با ماده کمپلکس دهنده است تا واکنش DNA با دیواره سلولی، فرار از فضای اندوزومی / لیزوزومی، حرکت در فضای سیتوپلاسمی و ورود به هسته و بطور کلی موانع موجود در مسیر انتقال ژن به هسته را پشت سر بگذارد.
فاکتور مهم دیگر در مسیر ترانسفکشن،وابستگی به سیکل سلولی است. بطوریکه مشاهده شده است ترانسفکشن سلولهای CHO چسبنده به روش CaPi در فاز S سیکل سلولی، بیان بیشتری را موجب شده است. همچنین روش ترانسفکشن با Liposome و PEI شاخه دار در اواخر فاز S کارآمد تر بوده است.
1-26)فاکتور های دخیل در کشت سلول های نوترکیب
* معلق یا چسبنده بودن سلول مورد استفاده( Suspension/Adherent)
* ثابت یا متحرک بودن کشت سلول Static/Shaking))
* انتخاب محیط کشت مناسب و شرایط محیط کشت
1-27)انواع سلول ها از نظر نحوه کشت
سلول های وابسته به بستر و سلول های غیر وابسته به بستر
1-27-1)سلول های غیر وابسته به بستر
یا( Anchorage Independent) که سلول های CHO DG44 جز این نوع هستند. به همین دلیل به صورت معلق در محیط کشت قرار می گیرند. سلولهای ترانسفرم شده در فرایند ترانسفکشن پروتئین های سطحی دخیل در ممانعت تماسی را از دست می دهند به همین دلیل قادرند به صورت چند لایه ای رشد نمایند.
1-27-2)سلول‌های وابسته به بستر
(Anchorage dependent) به کمک پروتئین‌های سطحی مانند اینتگرین‌ها، فیبرونکتین، کلاژن و لامینین به سطوح شیشه ای به دلیل داشتن بار منفی یا سطوح پلاستیکی که بارزدایی شده متصل می شوند و تکثیر آنها تا حدی ادامه می یابد که به صورت یک لایه سطح محیط را بپوشانند. در نهایت به دلیل ایجاد ممانعت تماسی میان سلولها رشد آنها متوقف می شود.
1-28) کشت معلق
Spinner Flask تکنیک معمول کشت معلق در مقیاس متوسط در روشTGE ، می باشد که کم هزینه تر از بیوراکتورهای Stainless Steel می باشد. لیکن پروسه پاکسازی و استریلیزاسیون آنها مشکل می باشد. همچنین همزن های مورد استفاده در این سیستمها پر هزینه هستند. . این سیستم در ابتدا برای کشت سلولهای باکتری و قارچی تعبیه شد ولی در سلولهای پستانداران نیز مورد استفاده قرار می گیرد.جایگزین مناسب برای این سیستمهای کشت، ظروف کشت به صورت فلاسکهای ارلن مایر یا تیوپ اسپین هستند که در بیوراکتور Orbital Shaking قرار می گیرند. فاکتورهای مهم در بیوراکتور orbital shaker که در میزان انتقال اکسیژن و تبعاً رشد و viability سلولها اثر گذارند عبارتند از:اندازه و شکل ظرف، سرعت حرکت چرخشی (Orbital) ، قطر حرکت چرخشی، حجم پرشونده ظرف و ویژگیهای سطحی ظرف .
انتقال اکسیژن مهمترین مساله محدود کننده در این سیستمهاست که بایستی به دقت مورد ارزیابی قرار گیرد.
بهره وری ترانسفکشن گذرا به چند عامل از جمله نسبت جمعیت سلول های ترانسفکت شده،ظرفیت رشد سلولها در طول زمان در یک محیط کشت , میزان رونویسی و ترجمه در سلول های میزبان و پردازش پروتئین نوترکیب از طریق سیستم های پس ترجمه ای بستگی دارد.
در فرایند بهینه سازی تولید پروتئین رشد سلول و ایجاد شرایط مناسب و رعایت فاکتور های دخیل در رسیدن سلول به بیشترین نیمه عمر, نیاز است.
بهره وری ترانسفکشن گذرا به چند عامل از جمله نسبت جمعیت سلول های ترانسفکت شده،ظرفیت رشد سلولها در طول زمان در یک محیط کشت , میزان رونویسی و ترجمه در سلول های میزبان و پردازش پروتئین نوترکیب از طریق سیستم های پس ترجمه ای بستگی دارد.
انتقال به پری پلاسم ، تخمیر در pH بالا، و استفاده از وکتور های با تعداد کپی برداری کم استفاده نمود.
به موازات این تلاش، تکنولوژی پیشرفته DNA نوترکیب برای استفاده از ارگانیسم های جدید تلاش های فوق العاده ای انجام داد.
به طور معمول در کشت سلول های حیوانی، سلول ها 4 تا 6 هفته بعد از دفریز به شراط ایده ال رشد می رسند.
کشت سلول های پستانداران در شرایط ازمایشگاهی نباز به یک ترکیب پیچیده از مواد مغذی شامل گلوکز و گلوتامین به عنوان منابع کربن و نیتروژن دارد.
1-29)انتخاب محیط کشت مناسب و شرایط محیط کشت
در کنار انتخاب سیستم کشت با کارآمدی بالا و میزبان مناسب، انتخاب محیط کشت مناسب از عوامل مهم در رشد سلولهای پستانداران و انتقال ژن کارامد درآنهاست. بنابراین یکی از حوزه های با قابلیت بهینه سازی بالا در TGE سلولهای پستانداران،بهینه سازی محیط کشت است. به جهت تسهیل مراحل تخلیص،محیط فاقد سرم ارجح است ولی از طرفی روش Calfection در محیط واجد سرم قابل انجام می باشد که همین موضوع جذابیت این روش را کم می کند. استفاده از پپتونهای با منشاء گیاهی و حیوانی به عنوان افزودنیهای محیط کشت و جایگزین سرم مورد بررسی قرارگرفته اند. [3]، همچنین مواردی چون انسولین و هورمونهای رشد را می توان برای افزایش رشد و Viability سلولها به محیط افزود..[4,6] در این طرح محیط کشت مناسب Chemically Defined در پروسه TGE مورد بررسی و بهینه سازی قرار می گیرد.
1-30)بهینه سازی شرایط کشت سلول
بهینه سازی فاکتور هایی مانند:
• شرایط کشت سلولی(Static / Shaking)
• محیط کشت مناسب (W/WO FBS, Feeding strategies)
• روش انتقال ژن( Transfection)
• کاهش ملایم دما Hypothermia) )
1-31)متابولیسم سلولی و تولید متابولیت های سلولی
گلوکز نه تنها متداولترین قند بلکه فراوان‌ترین ترکیب در طبیعت است که به حالت آزاد و یا در ترکیب یافت می‌شود گلوکز واحد تشکیل دهنده سلولز ، نشاسته و گلیکوژن می باشد و بزرگترین جزء ساختمانی بسیاری از الیگوساریدها بویژه ساکارز و بسیاری از گلیکوزیدها را تشکیل می‌دهد
1-31-1)نقش گلوکز در محیط کشت
گلوکز ، متابولیت عمده کربوهیدرات در غذای جانوری است و تقریبا، تامین کننده حداقل 50% از کل انرژی مورد نیاز سلول است و به صورت زنجیری دارای پنج عامل الکلی آلدئیدی می باشد .در طبیعت ، قندی راست ‌بر و دارای ساختار D و قدرت چرخشی 7/52+ می‌باشد. با تشکیل ساختمان حلقوی ، یک مرکز نامتقارن به تعداد مراکز قبلی افزوده می‌شود و دو ایزومر فضایی جدید که از نظر توان چرخش نور پلاریزه با هم تفاوت دارند، قابل تشخیص خواهند بود. این دو ایزومر ، به نامهای آلفا و بتا خوانده می‌شوند و از نظر خواص فیزیکوشیمیایی ، با همدیگر تفاوتهایی نشان می‌دهند
گلوکز به عنوان نقطه شروع “چرخه امبدن-میرهوف” که مسیر اصلی تجزیه “مونوساکاریدها” در سلول ها و در تخمیرهای میکروبی و تبدیل به پیرویک اسید می‌باشد. هگزوزهای دیگر به ناچار بایستی به شکل 1-فسفریک استر قبل از اینکه وارد چرخه گلوکز ایزومری تبدیل گردند.
D- گلوکز به سهولت بوسیله مخمر تجزیه گردیده و به الکل اتیلیک و دی‌اکسید کربن تبدیل میشود. همچنین این قند بوسیله باکتریها متابولیزه شده و موجب تشکیل انواع فراورده‌ها مانند هیدروژن ، اسیدهای استیک و بوتیریک ، الکل بوتیل ، استون و بسیاری از فراورده‌های دیگر می‌شود. در این تحقیق میزان کاهش گلوکز محیط کشت طی فرایند کشت بسته مورد بررسی قرار گرفته است.
گلوکز در سراسر غشای سلولی قادر به پخش بدون کمک از پروتئین های ناقل است و طی اکسایش تنفسی که منجر به تجزیه و اکسیداسیون و تبدیل آن به مولکولهای کوچکتر می شود تولید آب ، دی‌اکسید کربن و انرژی به شکل ATP می نماید. این فرایند طی سه مرحله انجام می‌گیرد. در مرحله گلیکولیز ، گلوکز 6 کربنی به دو مولکول سه کربنی تجزیه شده و مقدار کمی انرژی بوجود می‌آید. در مرحله دوم مولکولهای سه کربنی حاصل به نوبه

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید