داده شدند که در طول دوره کشت میزان گلوکز محیط کشت در این غلظت کمتر مصرف شد.برعکس گلوکز در غلظت g/L1 از پپتون های 1,2و6 نیز کمتر مصرف شده است.
میزان تولید آمونیاک در نمونه های تغذیه شده با پپتون در مقایسه با نمونه کنترل در روزهای 4 تا 7 کشت (اواسط دوره کشت) کمتر و در روزهای 8 تا 10( اواخر دوره کشت) افزایش یافته است.
میانگین آمونیاک تولید شده طی دوره 10 روز ه کشتg/l 51/0 وg/L 85/0 در غلظت g/L1و g/L2 از پپتون ها تعیین شد.
میزان لاکتات تولید شده در انتهای دوره کشت در حضور پپتون های 4,5و 6 بیشتر بوده است.جالب توجه است که این میزان در هر دو غلظت g/L1و g/L2 از پپتون ها mM 03/5 و mM 3/5 بود.
نمودار (3- a5)
نمودار( 3-b5 )
نمودار( 3- c5)
نمودار های (3-5) نشان دهنده تغییرات متابولیکی سلول CHODG44 تغذیه شده با غلظت g/L2 پپتون در شرایط کشت Fed-batch در محیط کشت ProCHO 5 می باشند.نمودار a میزان گلوکز, نمودار b میزان آمونیوم و نمودار c میزان لاکتات محیط را در روز 9 کشت نشان می دهند.
3-4-2)تغییرات متابولیکی در محیط CD DG44
همانطور که در نمودار( 3-6) نشان داده شده الگوی مصرف مواد مکمل در محیط CD DG44با غلظت g/L1 و g/L2 افزایش مصرف گلوکز پپتون نشان می دهد .همچنین میزان تولید آمونیوم در حضور پپتون تا روز 6 افزایش نشان داده و از روز 6 تا 10 این میزان ثابت بوده است. میانگین تجمع آمونیوم برای غلظت g/L1 58/0 و برای غلظت g/L2 mM83/0 می باشد.
شکل 8 نشان دهنده الگوی تجمع لاکتات در طول دوره کشت می باشد.به جز پپتون 3 تمامی پپتون ها لاکتات کمتری در غلظت g/L1 تولید نموده اند و میزان نهایی لاکتات تولید شده در روز 10 برای غلظت g/L1 و g/L2 به ترتیب برابر با 18/4و mM 46/5 بود.
نمودار( 3- a6)
نمودار( 3- b6)
نمودار(3-c6)
نمودار های (3-6) نشان دهنده تغییرات متابولیکی سلول CHODG44 تغذیه شده با غلظت g/L1 پپتون در شرایط کشت Fed-batch در محیط کشت CD DG44می باشند.نمودارa میزان گلوکز, نمودار b میزان آمونیوم و نمودار c میزان لاکتات محیط را در روز 9 کشت نشان می دهند.
3-4-3) بررسی تغییرات متابولیکی در محیط BRC CD
الگوی متابولیکی در سلول های CHO در محیط BRC نشان می دهد که استراتزی تغذیه ای با مکمل های پپتونی سبب بهبود شرایط رشد سلول ها در این محیط می شود.به این ترتیب که تغییر چندانی در میزان مصرف گلوکز مشاهده نشد.در رابطه با میزان آمونیاک تولید شده طی دوره کشت در محیط نیز با وجود افزایش تولید آمونیاک در حضور پپتون 4و 6 میانگین تولید آمونیاک در روز 10 به میزان g/L 43/0 اندازه گیری شد که این میزان نسبت به میزان g/L 5/0تولید شده در نمونه کنترل کمتر می باشد.همچنین تولید لاکتات در محیط BRC تغذیه شده با پپتون ها الگوی افزایش خاصی را نشان نداد.با این وجود میزان نهایی تولید لاکتات در حضور پپتون mM 03/6 را نشان داد که نسبت به میزان mM 6/5 لاکتات تولید شده در نمونه کنترل کمی بیشتر می باشد.
نمودار(3-a7)
نمودار (3-b7)
نمودار ( 3-c7)
نمودار های (3-7) نشان دهنده تغییرات متابولیکی سلول CHODG44 تغذیه شده با غلظت g/L1 پپتون در شرایط کشت Fed-batch در محیط کشت BRC می باشند. نمودار a میزان گلوکز, نمودارb میزان آمونیوم و نمودارc میزان لاکتات محیط را در روز 9 کشت نشان می دهند.
3-5)بررسی تاثیر پپتون ها بر میزان بیان پروتئین نوترکیب
همانطور که نتایج نشان می دهد در محیط ProCHO 5 غلظت g/L2 پپتون 5,4,6,3 افزایشی در میزان بیان پروتئین به میزان 55%,51%,41%و 35% به ترتیب مشاهده شد.ودر غلظت g/L1 تنها پپتون 1 در روز 9 افزایش 44% میزان بیان را نشان داد.برای غلظتg/L 1 از پپتون میزان متوسط آمونیاک در روز 9 برای غلظت mM 85/0و برای غلظتg/L 2 mM 51/0 را نشان داده است.
تجمع لاکتات به عنوان یک محصول جانبی در حضور پپتون های 4,5و 6 بیشتر بود.به طور جالبی الگوی یکسانی در میزان تجمع لاکتات در حضور غلظت g/L1و g/L2از این دو پپتون مشاهده شد.و میزان mM03/5و 3/5 لاکتات تولید شده در حضور این دو پپتون بوده است.
از طرف دیگر در محیط CD DG44 در غلظت g/L1 از پپتون های 4,5,6و 2 تیتر محصول تولید شده به مبزان 136%,120%,104%و 22% افزایش نشان داد در حالیکه در غلظت g/L2از پپتون افزایش چندانی مشاهده نشد.
در محیط BRC با غلظت g/L2ازپپتون های1, 6 و5 افزایش بیان به میزان 139%,36/60% و 64/33% در روز 9 مشاهده شد.و مشابه با محیط CD DG44 در غلظت g/L2از پپتون تفاوت چندانی در میزان بیان نسبت به نمونه کنترل مشاهده نشد.
نمودار(3-a8)
نمودار(3-b8)
نمودار های(3-8) درصد افزایش تولید t-PA در روز 9 با غلظت g/L1و g/L2 پپتونی را نشان می دهد.شکل a مربوط به محیط ProCHO 5 تغذیه شده با پپتون , شکل b مربوط به محیط CD DG44 تغذیه شده با پپتون می باشد.
3-6)بررسی تاثیر استراتژی تغذیه با پپتون های گیاهی در بهینه سازی TGE
نتایج بدست آمده از افزودن غلظت g/L2 از پپتون های 4,5و 6 در واکنش TGE بهینه شده در مراحل قبل نشان دهنده تاثیر مثبت حضور پپتون در انجام TGE می باشد و سبب ترانسفکت شدن سلول ها به ترتیب به میزان (%85/58,59/55و 45/54( شد.تاثیر هر3 پپتون فوق در فرایند بهینه سازی تقریبا مشابه یکدیگر می باشد. البته اثر مثبت پپتون 4 نسبت به 2 پپتون دیگر بیشتر می باشد.
نمودار (3-9)
نمودار های فلوسایتومتری هر یک از واکنش های TGE بهینه شده پس از ناثیر غلظت پپتونی مطلوب به ترتیب زیر می باشد:
بحث و نتیجه گیری کلی
TGE فرایندی است که طی بازه زمانی کوتاه با استفاده از روشی ساده میتوان مقادیر میلی گرم تا گرم از پروتئین نوترکیب خاصی را جهت انجام بررسی بر روی تاثیر داروها تولید نمود.سلول CHO رایج ترین سلول مورد استفاده جهت تولید پروتئین های دارویی می باشد.میزان تولید پروتئین طی واکنش TGE کمتر از پروتئین جاصل از واکنش SGE می باشد اما همین میزان نیز جهت انجام بررسی های پری کلینیکال بر روی داروها کافی می باشد. بیشترین میزان پروتئین تولید شده طی این واکنش در روز 5 بدست آمد.
جهت بهینه سازی فرایند ترانسفکشن به ترتیب با ثابت نگه داشتن میزان دانسیته سلولی , PEI و DNA میزان مناسب از این سه فاکتور موثر در ترانسفکشن مشخص شد.در نهایت جهت بررسی تاثیر پپتون های گیاهی موثر در افزایش بیان در فرایند SGE پپتون موثر مورد نظر نیز به واکنش ترانسفکشن بهینه شده با میزان مناسب از سه عامل ذکر شده با غلظت انتخابی افزوده شد که نتایج حاصل نشان دهنده تاثیر این پپتون در افزایش ترانسفکشن و نهایتا افزایش بیان را نشان داد. تاثیر پپتون می تواند ناشی از افزایش مدت زمان زنده ماندن سلول ها که طی بررسی میزان بیان پروتئین طی SGE بدست آمد باشد.
پپتون های مختلف به طور وسیعی در محیط کشت های فاقد سرم مورد استفاده قرار می گیرند.افزایش رشد سلولی به واسطه حضور پپتون ها در محیط های کشت بسته مشاهده می شود به طوری که افزودن پپتون ها به مجیط کشت سبب افزایش سریع رشد طی روز های اولیه کشت می شود و همین امر سبب کاهش سریع مواد مغذی و افزایش متابولیت های سمی می گردد ودر نهایت موجب کاهش سریع رشد سلول ها در محیط می شود سبب القاای آپوپتوز و ایجاد پروتئاز های از برنده ساختار پروتئین نوترکیب می گردد.
در پروسه های صنعتی استراتژی های مختلفی در رابطه با کاهش رشد سلول در طول دوره تولید محصول مورد استفاده قرار می گیرد.از آنجائیکه مکانیسم های مولکولی افزایش رشد سلول توسط پپتون ها به طور کامل شناخته نشده اثر پپتون ها به طور کامل شناخته نشده ,افزودن پپتون ها می تواند سبب ایجاد تداخل و ترکیب آمینواسیدهای پپتون ها با ترکیبات محیط کشت شود. با این وجود ارتباط بین آمنو اسید ها و تاثیر آنها در میزان رشد سلول و تولید پروتئین و رفتارهای متابولیکی در سلول های نوترکیب هنوز به خوبی شناخته نشده است.در این تحقیق تاثیر استراتژی تغذیه محیط کشت با پپتون های گیاهی دارای پروفایل آمینو اسیدی مشخص در رفتار متابولیکی سلول CHO بررسی شد.پپتون هایی که در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفتند از بین پپتون های با منشا گیاهی که به صورت تجاری در دسترس هستند و میزان آمینواسید کل و آزاد و همچنین وزن مولکولی آنها مشخص است استفاده نمودیم.این بررسی می تواند آغازی برای تجزیه و تحلیل های بعدی و دستیابی به راهکارهای جدید جهت بهینه سازی محیط کشت در راستای افزایش بیان پروتئین نوترکیب توسط سلول های پستانداران گردد.
تاثیر تغذیه پپتونی در محیط های کشت پایه فاقد سرم توسط بررسی میزان رشد سلول و پروتئین تولید شده و همچنین رفتار متابولیکی سلول CHO نوترکیب ارزیابی شد.
میزان رشد و افزایش تولید پروتئین تحت تاثیر پپتون ها بستگی به ترکیب مواد مغذی وجود در محیط کشت پایه دارد.نتایج کشت در سه محیط کشت ProCHO 5,CD DG44 وBRC نشان داد که سلول های CHO تولید کننده t-PA در محیط کشت ProCHO 5 نسبت به محیط CD DG44 و BRC میزان دانسیته و PCV بیشتری داشته اند.این نتیجه به اندازه کافی برای ما متقاعد کننده بود زیرا محیط ProCHO 5 یک محیط بهینه شده جهت تولید پروتئین های نوترکیب در سلول های معاق می باشد.
از طرف دیگر محیط BRCو CD DG44دارای مواد مغذی کمتری می باشند که این کاهش چشمگیر مواد مغذی سبب کاهش دانسیته سلولی و PCV شده است.استراتزی استفاده از پپتون ها نشان دهنده تاثیر محیط کشت مغذی در مقایسه با محیط کشت با مواد مغذی کمتر را نشان می دهد.
برای نشان دادن میزان غلظت بهینه پپتون مورد استفاده در محیط کشت بررسی هایی انجام شد.نتایج بدست آمده نشان داد که غلظت پپتون باید برای هر یک از محیط های پایه تنظیم شود.طبق نتایج بدست آمده در محیط های کشت پایه با میزان مواد مغذی بالا مانند محیط ProCHO 5 غلظت بالای پپتون در حد g/L2 سبب افزایش شدید تولید پروتئین می شود.علاوه بر این در غلظت g/L1 از پپتون های3, 4,5و 6 با پپتون 1 مقاسیه شدند.همانطور که نتایج نشان می دهد دانسیته سلولی در حضور غلظت g/L2 پپتون بیشتر از غلظت g/L1 می باشد..بر عکس برای محیط های پایه با مواد مغذی کمتر در غلظت g/L1 پپتون تاثیرات شدیدتری مشاهده شد ومیزان تولید پروتئین تولید شده در هر دو محیط افزایش بیشتری را نشان داد.در محیط CD DG44 پپتون 1,2و6 با غلظت g/L2 پپتون فقط سبب افزایش دانسیته سلولی شدند به بیان دیگر در محیط CD DG44 افزایش غلظت پپتون بر روی میزان بیان تاثیر چندانی ندارد.
این نتایج همگی موید این هستند که برای هر محیط کشت پایه میزان خاصی از غلظت پپتون جهت بهینه سازی مورد نیاز است.در محیط ProCHO 5 پپتون های 3 ,4 ,5 و6انتخاب شدند.در حالیکه جهت بهینه سازی محیط کشت CD DG44 پپتون های 2,5,4و6 انتخاب شدند جهت بهینه سازی محیط پایه BRC پپتون های 2,5,1و6 انتخاب شد.
این تفاوت ها به عنوان یک راهکار کلیدی جهت بهینه سازی محیط های کشت مورد استفاده قرار می گیرد.در این مطالعه تلاش نمودیم تاثیر الگوهای آمینواسیدی پپتون ها را بر روی پاسخ های سلول های نوترکیب بررسی نمائیم.در گام اول مشاهده شد پپتون های با منشا کازئین و سویا نتایج یکسانی را برای محیط های مختلف نشان نمی دهند.2 پپتون با منشا کازئین3 , 4 و 2پپتون 5 و6 با منشا سویا در محیط ProCHO 5 سبب افزایش بیان می شوند.در محیط CD DG44 پپتون های با منشا سویا 2, 5 و6 و یک پپتون با منشا کازئین سبب افزایش بیان می شود..
در محیط پایه BRC 2

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید