بیش از حد سلول ها
2- آلودگی باکتریایی
3- درصد بالای 2 CO در انکوباتور
4- تغییر رنگ محیط به ارغوانی می تواند به علت موارد زیر باشد:
• رشد اندک یا متوقف شده سلول ها
• آلودگی قارچی
• غلظت اندک 2 CO در انکوباتور
2-13) شمارش سلول های rCHO DG44
از آنجایی که امکان ردیابی سلول ها و مشاهده سلول ها به صورت چشمی امکان پذیر نمی باشد از روش های آزمایشگاهی مانند رنگ آمیزی با تریپان بلو و شمارش سلولی توسط لام نئوبار هموسایتومتر که اساسا برای شمارش سلول های خونی طراحی شده استفاده می شود.
• لام نئوبار ضخیم و دارای یک سری خطوط عمودی و افقی به صورت مشبک می باشد که میانگین تعداد سلول ها در 4 خانه که خود از 16 خانه کوچکتر تشکیل شده شمارش می گردد. سوسپانسیون سلولی پس از پیپتینگ مناسب جهت جدا شدن کامل سلول های چسبیده به هم در زیر لامل بر روی این لام لود می شود.
• پیپتینگ مناسب سوسپانسیون سلولی قبل از لود کردن بسیار اهمیت دارد، این کار به منظور دقت بیشتر و شکستن توده های سلولی به هم چسبیده که کار شمارش را با سختی مواجه می کند صورت می گیرد. تعداد سلو های شمارش شده در این 104خانه نشان دهنده میزان سلول ها در هر میلیمتر مکعب از سوسپانسیون است.
• از رنگ تریپان بلو برای رنگ آمیزی سلولها و افتراق بین سلولهای مرده و زنده استفاده می شود. برای شناسایی سلولهای زنده از مرده میتوان از میزان نفوذپذیری سلولها به رنگهای مختلف نیز استفاده کرد. سلولهای زنده نسبت به برخی از رنگها نفوذ پذیر بوده و با آنها رنگ میشوند ونسبت به برخی دیگر از رنگها نفوذ ناپذیر می باشند. هنگامی که این سلولها می میرند، نسبت به همه انواع رنگها نفوذپذیر شده و رنگ وارد سلولهای آنها می شود. رنگ تریپان بلو وارد جداره سلولی سلولهای مرده می شود و آنها را به رنگ تیره در می آورد در حالی که سلولهای زنده شفاف باقی می مانند.
2-13-1)اصول شمارش سلول
بررسی روند رشد و شمارش سلول ها به کمک لام نئوبار به روش زیر انجام شد:
1- لام نئوبار (هموسایتومتر) با الکل اتانول 70% به دقت و با احتیاط تمیز نموده تا سطح نسبتا نقره ای نئوبار را خراشیده نشود.
2- لامل برروی قسمت میانی هماسیتومتر قرارداده شد.
3- نمونه سلولی که کاملا مخلوط شده به دقت پیپتاژ شده تا توده های سلولی در نمونه باقی نماند.
4- حدود µl20 از نمونه سوسپانسیون سلولی با پیپت یا سمپلر برداشته شد.
5- سوسپانسیون سلولی را در لبه محفظه هماسیتومتر به آرامی تخلیه نموده به نحوی که نمونه به آرامی از نوک پیپت به زیر لامل کشیده شود.
6- لام زیر را میکروسکوپ قرار داده و با لنز X20 فوکوس نموده تا خطوط مشبک ( Grid Lines ) درهر محفظه مشاهده گردد.
7- با حرکت دادن لام میدان دید درناحیه  مرکزی شبکه ( Grid) به گونه ای تنظیم می شود که بزرگترین ناحیه ای که در دید قرار می گیرد توسط سه خط موازی محصور شده باشد، تمام میدان دید این محدوده که مساحت آن2 mm1است با یک لنز X20استاندارد پر می شود.
8- با کمک نواحی مربع شکل کوچکتر ، سلول های این محدوده یک میلیمتر مربعی شمارش شد.
• برای از بین بردن خطای شمارش و شمارش مجدد سلول های قرار گرفته بر روی اضلاع مشترک سلول های درون هر مربع کوچک و سلول های قرار گرفته روی اضلاع بالایی و چپ آن بدون در نظر گرفتن سلول های روی اضلاع پایین و راست آن شمارش می شود.
9- برای شمارش دقیق ، لازم است سلولهای 4 مربع شمرده شوند و میانگین محاسبه گردد.
شکل( 2-3)
فرمول محاسبه تعداد سلول در حجم عبارت است از:            
c = n/v
تعداد سلول در حجم c=  
4×2/تعداد سلولهای شمارش شده   n=
حجم نمونه سوسپانسیون سلولی  v=
در یک لام نئوبار عمق محفظه mm1/0است. از آنجاییکه شمارش در همان محدوده مرکزی با مساحت 2mm 1/0 که با سه خط موازی محصور شده انجام شده است، حجم نمونه برابر است با 3mm 1/0 که آنرا می توان بصورتml   104×1 نوشت.
شکل(2-2)
2-13-2)تعیین درصد سلول های زنده Viability))
سلولهای زنده با ديواره شفاف و سلولهای مرده آبی رنگ هستند. حداقل 90 درصد سلول ها باید زنده باشند تا امکان استفاده در مطالعه وجود داشته باشد.
• تعداد سلول های زنده و مرده را به طور جداگانه شمارش نموده و تعداد سلول های زنده را بر مجموع سلول ها شمارش شده تقسیم نموده و جاصل را در 100 ضرب می نمائیم.
100×مجموع سلول های زنده و مرده /تعداد سلولهای زنده :درصد سلول زنده ( Viability )
2-13-3) انجماد سلولها و ذخیره سازی آنها Cell Freezing))
همواره برای رده های سلولی که به صورت مکرر تکثیر می شوند و همچنین رده های سلولی که در نهایت از بین می روند جهت جلوگیری از جهش سلولی و همچنین محافظت از رده سلولی در مقابل آلودگی وسایر اتفاقات نامطلوب باید ذخیره ای در فریزر نگهداری شود.
فرایند فریز کردن سلولها تقریبا در تمامی رده های سلولی به صورت مشابه انجام می پذیرد.هنگامی که سلولها در فاز تصاعدی رشد هستند بهترین زمان برای ذخیره سازی آنهاست.
DMSOیک ترکیب نگهدارنده مناسب جهت فریز نمودن سلول هاست و با جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ مانع یخ زدن غشای سلول ها و مرگ آنها می شود .فرایند فریز نمودن سلول ها به صورت چند مرحله سرمایشی انجام می گیرد. به چنین فرایندی که درطی آن سلول ها به تدریج سرد می شوند فریز کردن تدریجی اطلاق می شود.
سلول هاي مورد نظر نبايستي هيچ گونه آلودگي ميكروبي داشته باشند. بايد سلول ها سالم و جوان بوده و در فاز لگاريتمي رشد باشند و بيش از 90 درصد قابليت حيات داشته باشند. بدين منظور از سلول هايي كه در مرحله پيش از رسيدن به مرحله تراكم سلولي هستند استفاده مي شود .  
اصول کار:
➢ میزان سلول های زنده باید به بیش از 90 درصد ( viable 90% ) برسد. رشد بیش از حد یا کم سلول ها میزان حیات سلول ها در فرایند انجماد را کاهش خواهد داد.
➢ ظرفیت هر ویال برای ذخیره سازی سلولها بین  cell/ml 106×4 تا cell/ml 107×2 می باشد.
➢ سلول ها را در محیط کشت ویژه  انجماد در حجم ml1 به هر ویال منتقل می شود.
➢ ویال های حاوی سلول را در دمای  °70- باید برای حدود 16 ساعت ( overnight ) نگهداری شوند.
➢ در نهایت ویال ها در محفظه های انجماد درون مخزن ازت مایع° 196- سانتی گراد قرار داده می شوند.
برای نگهداری بلند مدت: باید محیط کشت سلول حاوی 60% محیط کشت , FBS 30% DMSO + 10% باشد
2-14)ترانسفکشن سلول rCHO DG44
2-14-1)پلاسمید حاوی ژن
پروتئین مدل مورد ارزیابی این پروژه t-PA می باشد که کاست ژنی آن طی طرح های تحقیقاتی گذشته وارد پلاسمید Ptracer–SV40 شده است .این پلاسمید واجد ژن GFP است که بعنوان نشانگر،مورد استفاده قرار می گیرد و همچنین انتخابگر Zeocin در این پلاسمید وجود دارد.
2-14-2)تهیه DNA‌
پلاسمید موردنظر در سویه E.coli Top10F’ در محیط LB با آمپی سیلین – زئوسین تهیه گردید. تخلیص DNA با کیت تخلیص وپروتکل پیشنهادی،صورت گرفت. میزان DNA به روش الکتروفورز ژل آگاروز و اسپکترومتری- UV تعیین می گردد. پلاسمیدهای تخلیص یافته در WFI در cْ -20 نگهداری می شوند.
2-14-3)کشت سلول
رده سلولی CHO-DG44 (dhfr-) آداپته شده به شرایط کشت معلق بصورت روتین در ظروف کشت شیشه ای 250 میلی لیتری، محیط کشت ProCHO 5-CDM واجد mg/L 61/13 هیپوگزانتین و mg/L88/3 تیمیدین (HT) و mM4 گلوتامین در شرایط فاقد سرم کشت داده می شوند. Starting cell density :Cells/ml 105×5/3 در 100 میلی لیتر محیط کشت بوده و سلولها هر 3-4 روز یکبار مورد subcultivation قرار می گیرند. شرایط انکوباسیون سلولها در ᵒ37 در انکوباتور orbital shake افقی با قطر چرخشی 5/2 سانتی متر و 2Co5%و رطوبت 95%وباسرعت چرخش 110 rpm خواهد بود.
شمارش سلولی به روش هموسایتومتر با کمک تریپان بلو برای تعیین چگالی سلولی و viability سلولها انجام می شود.
2-15)بهینه سازی فرایند TGE
2-15-1)ترانسفکشن به روش PEI
یک روز قبل از ترانسفکشن سلول ها در محیط کشت تازه CD DG44 کشت داده شدند.در روز ترانسفکشن سلول ها سانتریفوژ شده و با دانسیته cell/ml106×4 در فالکون های ml50 فیلتر دار بیوراکتور کشت همراه با µg 25/1 پلاسمید DNA و غلظت های PEI(1.5,2,2,5,3,4µg/ml) حل شده در mM 150 Nacl که min10 در دمای اتاق قرار داده شد ترانسفکت شدند.کشت سلول در انکوباتور با حرارت °37 و میزان 2 CO 5%و رطوبت 85%قرار داده شد. h 3پس از ترانسفکشن حجم محیط های کشت هر فالکون به ml10 رسانده شد , به این ترتیب میزان دانسیته سلولی به cell/ml106×4 رسید.
2-15-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE
یک روز قبل از ترانسفکشن سلول ها در محیط کشت تازه CD DG44 کشت داده شدند.در روز ترانسفکشن سلول ها سانتریفوژ شده و با دانسیته های مختلف (106× 4 , 106× 3 , 106× 2, 106×1,105×5 ,105×2 )در فالکون های 50 فیلتر دار بیوراکتور کشت همراه با µg25/1 پلاسمید DNA و غلظت PEI(2µg/ml) حل شده در Nacl150 mM که min10 در دمای اتاق قرار داده شد ترانسفکت شدند.کشت سلول در انکوباتور با حرارت °37 و میزان 2 CO 5% و رطوبت 85% قرار داده شد. h 3پس از ترانسفکشن حجم محیط های کشت هر فالکون به ml 10رسانده شد و دمای انکوباسیون به °31 کاهش داده شد.
2-15-3)بررسی میزان بهینه DNA جهت انجام TGE
یک روز قبل از ترانسفکشن سلول ها در محیط کشت تازه CD DG44 کشت داده شدند.در روز ترانسفکشن سلول ها سانتریفوژ شده و با دانسیته cell/ml105×5در فالکون های ml50فیلتر دار بیوراکتور کشت همراه با غلظت های مختلف (cell/ml106/µg25/1,1, 7/0, 625/0, 5/0, 25/0) پلاسمید DNA و غلظت mg/ml2PEI(حل شده در mM 150 Nacl که min10 در دمای اتاق قرار داده شد ترانسفکت شدند.کشت سلول در انکوباتور با حرارت °37 و میزان 2 CO 5%و رطوبت 85% قرار داده شد.h3 پس از ترانسفکشن حجم محیط های کشت هر فالکون به ml10 رسانده شد و دمای انکوباسیون به °31 کاهش داده شد.
2-15-4)اندازه گیری میزان درصد ترانسفکشن
2-15-4-1)اندازه گیری GFP به روش فلوسایتومتری
سلولهای کشت داده شده درفالکون های فیلتر دار ml50 با افزودن ml 5/0PBS حاوی 1% تریتون x 100لیز شده پس از یک ساعت agitation در º37 سانتی گراد با دستگاه فلوسایتو متر در طول موج تحریکی nm985 و طول موج انتشاری nm530 میزان RFU اندازه گیری گردید.
2-16)افزودن غلظت های متفاوت پپتون های گیاهی به محیط های کشت
6 پپتون گیاهی با پروفایل آمینو اسیدی مشخص (جدول2-2) با غلظت های g/L1و g/L2 به سلولهای در حال رشد با Viability 90% اضافه شد.شمارش سلول , اندازه گیری PCV% و نمونه برداری از محلول رویی حاصل از سانتریفوژ سلول ها طی محاسبه PCV برای اندازه گیری میزان بیان پروتئین توسط روش Elisa و همچنین اندازه گیری متابولیت های سلولی تولید شده و گلوکز مصرف شده توسط سلول ها انجام شد.
پپتون های مورد استفاده جهت بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب در جدول 2 ذکر شده است.
جدول(2-3)
درصد آمینواسید هر یک از پپتون های مورد لستفاده به صورت شماتیک در نمودار (2-1) نشان داده شده است.
نمودار (2-1)
خصوصیات فیزیکوشیمیایی و میکروبیولوژی هر یک از پپتون ها در جداول زیر نشان داده شده است.
جدول (2-4)
جدول(2-5)
جدول(2-6)
جدول)2-7)
جدول(2-8)
جدول( 2-9)
2-16-1) تعیین پروفایل رشد
روش (Packed Cell Volume) شکل (2-2) حجم سلول پک شده

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید