زیادی برای فیبرین دارد و اتصالش به فیبرین فعالیت آنرا 1000 برابر افزایش می دهد.این افزایش شدید به محل های اتصال اختصاصی روی سطح فیبرین نسبت داده می شود که سبب متراکم شدن و جهت گیری صحیح t-PA با سوبسترای خود یعنی پلاسمینوژن می گردد و به این ترتیب تجزیه لخته را به صورت موثر پیش می برد.
1-15)غلظت-فعالیت و نیمه عمر
حد پایه غلظت t-PA در پلاسمای گرفته شده از یک فرد سالم در حالت استراحت در صبح هنگامی که با روش های ایمونولوژیک اندازه گیری شود برابر با 5 میکروگرم در لیتر می باشد [28].
این در حالی است که فعالیت اندازه گیری شده در همین زمان IU/ml5/0 که معادل 1 میکروگرم در لیتر است می باشد [29].
این اختلاف بین مقدار آنتی ژن و سطح فعالیت می تواند به این امر مربوط باشد که اکثر t-PA پلاسما به شکل کمپلکس غیر کارا و عمدتا با مهار کننده اصلی آن PAI-I می باشد.
البته افزایش حاد در سطح t-PA در پاسخ به محرک هایی مثل ورزش ,استرس روحی ,گرفتگی سیاهرگ و بعضی از داروها دیده می شود. t-PAبه وسیله متابولیسم سریع کبدی از گردش خون حذف می شود [30].
نیمه عمر طبیعی برای t-PA آزاد حدود 6 دقیقه است.این مقدار در بیماری های دارای تمایل به تشکیل لخته که درآنها سطح PAI-I افزایش دارد به طور قابل توجهی کاهش می یابد [31].
t-PA مشتق شده از Bowes melanoma از یک زنجیره پلی
از طرفی به منظور ایجاد مقاومت به مهار کننده نوع اول فعال کننده پلاسمینوژن، توالی آمینواسیدهای Khrr در 128-131aa با توالی AAAA در t-PA جدید طراحی شده جایگزین شد که فعالیت ویژه پروتئین 570 IU/μg نشان داد و مانند tenecteplase دارای مقاومت به PAI-1 بود[20].
بنابراین چنانچه این پروتئین جدید مورد ارزیابی های بیشتر قرار گیرد امید بسیار بالایی را در درمان بیماران مبتلا به ترومبوآمبولی خواهد داشت.
از آنجایی که پروتئین درمانی مورد نظر ما باید شکل بیولوژیکی فعال خود را حفظ نماید و folding مناسب و تغییرات پس از ترجمه صحیحی داشته باشد، سلول میزبان CHO انتخاب شده است. امروزه تقریبا 70%داروهای پروتئین نوترکیب در سلول های CHO تولید می شوند. بیان پروتئین در CHO اثرات بسیار زیادی روی ویژگی های محصول و بیشترین میزان محصول قابل قبول را خواهد داشت. folding مناسب پروتئین و تغییرات پس از ترجمه که توسط میزبان CHO ایجاد می شود، خصوصیات فارماکوکینتیک و فارماکودینامیک محصول را دیکته می کند و بنابراین حلالیت solubility، پایداری stability، فعالیت بیولوژیکی biological activity و زمان حضور residence time پروتئین در انسان را مشخص می نماید. از طرفی safety محصول حائز اهمیت می باشد . طی فرایند Downstream محصولات بدست آمده از سلول CHO (خالص سازی)، آلودگی با DNA خود CHO بسیار کمتر (کمتر از پیکوگرم) می باشد [21].
در این تحقیق این فرم دارای حذف وارد سلولهای CHO شده است. و سلول های مشتق شده از کلیه انسان جنینی و تخمدان هامستر چینی برای تولید پروتئین در این پژوهش ترجیح داده شده است.
t-PA به طور اختصاصی و نسبتا قوی به لخته های خون متصل شده و پلاسمینوژن به دام افتاده درلخته های خون را به دام می اندازد و لخته خون را از بین می برد.نیمه عمر این گلیکو پروتئین که به طور عمده در کبد ساخته شده و به فرم غیرفعال وارد سیستم گردش خون می شود و نیمه عمر ان حدود 2 روز است.
چنانچه t-PA همراه با تزریق هپارین مصرف شود طی 90 دقیقه سبب حل شدن لخته های تشکیل شده در سرخرگ کرونری می گردد.
از آنجائیکه t-PA ایمونوژن و پیروژن نمی باشد وبه طور اختصاصی به لخته های فیبیرینی متصل و پلاسمینوژن داخل لخته ها را فعال می کند ریسک خونریزی آن بسیار کاهش می یابد. به همین دلیل عوارض فعال کننده پلاسمینوژن بافتی در مقایسه با استرپتوکیناز ناچیز می باشد.
وجود شباهت میان t-PA و v-PA Vascular Plasminogen Activator)) و فعال کننده پلاسمینوژن خونی با کمک آنتی بادی ضد فعال کننده پلاسمینوژن ثابت شده است.اما در رابطه با u-PA هنوز اختلاف نظر وجود دارد.
همچنین به دلیل پرچالش بودن تولید محصول در سیستم پروکاریوتی فرایند بازپیچش پروتئین تولید شده مولکول های کوچکتر فعالی به نام Reteplase و Lanatoplase طراحی و ساخته شد.
1-20-8) میزبان های رایج در تولید پروتئین های نوترکیب
E.coli برای بیان پروتئینهای نوترکیب به دلیل رشد سریع در محیط، کم هزینه بودن ،آسانی دستورزی ژنتیکی، مشخص بودن ویژگیهای ژنتیکی و فیزیولوژیکی، توان بیان بالای پروتئین، میزبان مناسبی محسوب می گردد لیکن پروتئینهای تولیدی در این میزبان،اغلب فاقد تغییرات پس ترجمه ای مناسب و تاخوردگی مطلوب بوده و به فرمهای تجمعی نامحلول در می آیند.برخلاف پروکاریوتها، میزبانهای یوکاریوتی قادر به انجام تعدادی از تغییرات پس ترجمه ای مانند ایجاد باندهای دی سولفید، برش پروتئولیتیک و گلیکوزیلاسیون هستند که منجر به تولید پروتئینهای فعال و واجد عملکرد می گردد.
پروتئینهای نوترکیب تولیدی در مخمر عمدتاً در Pichia pastoris و یا S.cerevisiae تولید می شوند. قارچها رشد سریع و مقرون به صرفه ای از خود نشان می دهند و دستورزی ژنتیکی در آنها آسانتر از سایر یوکاریوتها انجام می گیرد.قارچها همچنین قادر به انجام برخی تغییرات پس ترجمه ای مانند گلیکوزیلاسیون های ساده هستند. عدم توان این میزبانها برای انجام تغییرات پس ترجمه ای پیچیده،استفاده از آنها را محدود می سازد .
کشت سلولهای حشرات نیز روش مناسبی برای تولید پروتئینهای نوترکیب بویژه با وکتورهای نوترکیب باکلوویروسی محسوب می گردد. این سلولها قادر به رشد آسان در تعداد بالا هستند. مشکل اصلی این سیستمهای کشت،ظرفیت محدود آنها در ایجاد تغییر در پروتئینهایی است که بصورت پیش ساز تولید می شوند و از طرفی میزان بیان در این میزبانها بدلیل احتمال تجمع پروتئین در فرمهای نامحلول محدود است.همچنین تفاوتهایی در الگوی گلیکوزیلاسیون بین این میزبان و سلولهای پستانداران مشاهده می گردد .
در کشت های معلق از سلولهای گیاهی به ویژه تنباکو و گیاهان دستورزی شده نیز برای بیان پروتئینهای نوترکیب استفاده می شوند.مهمترین مزیت استفاده از سیستمهای کشت سلول گیاهی in vitro سرعت تولید بالا و توان تغییر محیط رشد برای کنترل بیشتر پروتئین تولیدی است. نقطه ضعف این سیستمهای تولیدی سرعت رشد کم سلولهای گیاهی و تفاوت در الگوی گلیکوزیلاسیون نسبت به سلولهای پستانداران است. تولید پروتئین در گیاهان تراریخته نیز حوزه تحقیقات زیادی بوده است[23].آسانی و کم هزینه بودن کشت مهمترین مزایای این سیستم بیانی است. لیکن تخلیص پروتئین،بسیار مشکل تر از کشت سلولهای گیاهی می باشد[23].
سلولهای پستانداران قادر به تولید بیشترین پروتئین به لحاظ درمانی می باشند، زیرا این گروه تغییرات پس ترجمه ای ضروری را به دقت زیادتری نسبت به همه میزبان های ذکر شده انجام می دهند. متاسفانه سلولهای پستانداران در نگهداری در حالت کشت پر هزینه بوده و رشد کندتری نسبت به موارد ذکر شده در بالا دارند. همچنین این سلولهای مستعد آلودگی ویروسی هستند که احتمال آلودگی محصول نهایی را ایجاد می کند.
1-21)انتخاب رده سلولی مناسب
معیار های انتخاب سلول جهت بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب
1-بیان بالای محصول مورد نظر , حفظ دانسیته بالای سلول های زنده و داشتن شرایط ژنتیکی پایدار
2-قابلیت استفاده در حجم های بالا
3-دارا بودن توانایی انجام فرایند های پس ترجمه ای مانند گلیکوزیلاسیون
4-بی خطر بودن از نظر کاربری توسط انسان
1-22)رده های سلولی رایج در بیان پروتئین های نوترکیب
1-23)مزایای CHO
از آنجائیکه این سلول نسبت به سایر سلولها پایدارتر و فرایند ترانسفورماسیون جهت تولید پروتئین به میزان بالا در آن آسان تر می باشد جهت انجام فرایند بهینه سازی مورد استفاده قرار گرفت.
1-24)روش های بیان ژن
1-24-1)سیستم بیان پایدار ژن Transient Gene Expression))
هدف اصلی در تولید پروتئینهای نوترکیب در سلولهای پستانداران،ایجاد رده سلولی پایدار (Stable) واجد ژن مورد نظر، در ژنوم سلول همراه با بیان پایداری از پروتئین در بازه زمانی خاص می باشد. که این امر مستلزم مراحل هزینه بر و طولانی جداسازی و تعیین ویژگی رده های سلولی Stable ، ازدیاد رده سلولی مورد نظر با بیان بالا از میان مجموعه ای از سلولهای ترانسفکت شده است،
در موارد زیادی ممکن است که کاندیدهای پروتئینی زیادی یا مشتقات زیادی از یک کاندید پروتئین درمانی ،مورد ارزیابی اولیه درمانی قرار بگیرند. همچنین برای برخی پروتئین ها مقادیر نسبتاً کم برای رفع نیاز، کافی می باشد. استفاده از این روش در پزشکی شخصی نگر Individualized ؛ نیز جایگاه ویژه دارد[25,26].
1-24-2)سیستم بیان موقت ژن Transient gene expression))
امروزه کلیه پروتئینهای نوترکیب موجود در بازار که در سلولهای پستانداران تولید می شوند، حاصل رده های سلولی پایدار هستند که ژن نوترکیب وارد ژنوم میزبان گردیده است. پلاسمید حاوی ژن به صورت پایدار و در کروموزوم ژن میزبان وارد شده است Stable Gene Expression (SGE). روش جایگزین برای آن تکنیک روش Transient Gene Expression (TGE)، می باشد که روش سریع و اسان برای تولید مقادیر مناسب پروتئینهای نوترکیب در سلولهای پستانداران محسوب می گردد. در این تکنیک بیان پروتئین مورد نظر توسط پلاسمید حاوی ژن ترانسفکت شده که بصورت خارج کروموزومی باقی می ماند صورت می پذیرد.
بیان موقت پروتئین(TGE (Transient Gene Expression جهت تولید سریع در میزانهای میلی گرم تا گرم از پروتئین مورد نظر ) در مقیاس بالا روش مناسبی می باشد. دو فاکتور اساسی دخیل در این سیستم پروسه کشت سلولی و روش انتقال ژن می باشد.
بیان ژن موقت در سلولهای HEK به دلیل توانایی آن برای ارائه قابل توجهی مقدار پروتئین در مدت زمان معقول توجه شمار زیادی از تولیدکنندگان را به خود جلب نموده است.
از آنجا که سلولهای CHO و HEK در گلیکوزیلاسیون N- ا تفاوت هایی را نشان داده اند ،در طول سال های گذشته TGE در سلول های CHO به عنوان روشی برای تولید پروتئین با ویژگی های مشابه با نوع تولید شده در مقیاس بزرگ برای آزمایش های پیش بالینی و بالینی مورد توجه عمده قرار گرفته است.
بیان ژن گذرا (TGE) یک روش سریع برای تولید پروتئین نوترکیب از میلی گرم به مقدار گرم در سلول های پستانداران معلق ، به خصوص همستر چینی تخمدان (CHO) و کلیه جنین انسان-293 (HEK-293) سلول می باشد.
تا کنون روش TGE برای تولید پروتئین در تستهای بالینی به دلیل نیاز به بیان زیاد پروتئین با کیفیت ثابت استفاده نشده است. علی رغم اینکه با استفاده از روش TGE تا مقدار L100 نیز Scale-Up شده است میزان بیان حجمی (volumetric productivity ) حاصل از این روش برای سلولهای ترانسفکت شده CHO-DG44 بسیار کمتر از مقادیر حاصل از روش (SGE ) Stable Gene Expression می باشد.
جهت بیان موقت پروتئین در مقیاس Pilot-Scale کشت سلولهای پستانداران در حالت تعلیق ضروری می باشد. Orbital Shake روش مناسبی برای کشت سلولها در مقادیر سلولی بالاست. کم هزینه بودن و عدم نیاز به تجهیزات خاص از مزایای این تکنیک است.
نخستین پروتئین نوترکیب از سلولهای پستانداران که به بازار دارویی وارد شد فعال کننده پلاسمینوژن بافتی (Activase, t-PA) از شرکت Genentech در سال 1986 بوده پس از آن تا سال 2004 بطور میانگین هر سال 9-7 پروتئین نوترکیب از U.S.FDA پذیرش می گرفت [25].
در مواردی که مقادیر میلی گرم تا گرم از پروتئین نوترکیب، مورد نیاز است تکنولوژی موفق TGE

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید