(C‍‍‍? 30) به مدت 5 روز نگهداري گرديد. پس از گذشت 5 روز و اطمينان از رشد مطلوب ميکروارگانيسم، نمونهها جهت استفاده در آزمايشات بعدي به داخل يخچال (C‍‍‍? 4) منتقل شدند.

2-3- محيط نگهداري
مناسبترين محيط جهت رشد و نگهداري باکتريها محيط کشت جامد ميباشد. در اين مطالعه از محيط کشت پيشنهادي بانک ميکروبي آلمان (DSMZ, Medium 81) براي تجديد کشت استفاده شد. جهت تهيه محيط کشت جامد، ابتدا محيط كشت مايع (جدول 2-1) تهيه شده را روي هيتر51 (ARE, EU) گذاشته و آگار تدريجا به آن افزوده شد. مقدار 5 ميليمتر از محيط آگار تهيه شده، قبل از اتوكلاو در داخل لوله هاي آزمايش ريخته شد. به اندازهاي كه زماني كه لوله را شيبدار قرار داديم از سر لوله تا انتهاي آن با يك شيب ملايم امتداد يافت. اين روش لزوما براي افزايش سطح بيشتر آگار در داخل لوله انجام پذيرفت. پس از پايان اتوکلاو، لولههاي آزمايش محتوي آگار را به صورت شيبدار قرار داده تا آگار بسته شود. پس از سرد شدن محيطکشت آگار، با استفاده از مخمر موجود در محيطكشت رشد، آنها را تلقيح کرده و به مدت 48 ساعت در دماي مناسب C‍‍‍? 30 نگهداري شدند تا رشد ميکروارگانيسم صورت پذيرد. پس از رشد ميکروارگانيسم محيط کشت تلقيح در دماي C‍‍‍? 4 در يخچال نگهداري شد. محيط کشت تلقيح هر ماه يکبار جايگزين ميگرديد.

2-4- محيط کشت تلقيح52
محيط کشت تلقيح جهت تهيه بيشترين توده سلولي فعال براي تلقيح به محيط کشت اصلي است بطوري که در کمترين زمان بيشترين بهرهوري حاصل شود. بايد به اين نکته توجه داشت که هر چه ترکيبات و شرايط رشد محيط تلقيح و فرايند بيولوژيکي متفاوتتر باشد فاز تاخير رشد باکتري براي سازگاري با محيط جديد طولانيتر خواهد شد. مواد ذکر شده در جدول 2- 1 به عنوان مواد تشکيل دهنده محيط کشت تلقيح مورد استفاده قرار گرفت.

2-5- محيط کشت فرايند بيولوژيکي
مواد شيميايي ذکر شده در جدول 2-1 بعنوان محيط کشت فرايند بيولوژيکي در آزمايشات اصلي مورد استفاده قرار گرفته است. Na2HPO4، Fe(NH4)Citrate و NaHCO3 جهت جلوگيري از ايجاد رسوب بصورت جداگانه اتوکلاو گرديدند. منبع کربن نيز بطور جداگانه تهيه و استريل شد تا از کاراملي شدن منبع قند يا به اصطلاح از پديده قهوهايشدن53 جلوگيري شود. پس از استريلنمودن تمامي اجزاي محيطکشت منبع كربن، نمكهاي نيترات و فسفات در زير هود لامينار و نزديک شعله به همديگر افزوده شده بودند. بعد از مخلوط شدن، محلولي شفاف از محيط كشت جهت آزمايشات حاصل گرديد.

2-6- آماده سازي کشت تلقيح
محيط کشت مايع مطابق با جدول 2-1 به ميزان 150 ميليليتر در يک ارلن 500 ميليليتري تهيه گرديد و پس از استريلشدن و رسيدن به دماي محيط، عمل تلقيح صورت گرفت. سپس در فواصل زماني منظم (هر 12 ساعت) و بمدت 144 ساعت، نمونهبرداري جهت تعيين ميزان جذب و ميزان مصرف گلوکزصورت پذيرفت. ميزان جذب نمونهها توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (Jenway 6305, UK) و در طول موج 620 نانومتر قرائت گرديد. از آب مقطر نيز بعنوان شاهد استفاده شد. گلوکز نيز با استفاده از روش DNS 54 تعيين گرديد.

2-7- شرايط فرايند بيولوژيکي و نمونه برداري
در بخش اول از سيستم غيرپيوسته55 بصورت ارلن ماير استفاده شد. 200 ميليليتر از محيط کشت فرايند بيولوژيکي در ارلنهاي 1 ليتري تهيه و سپس 10 ميليليتر (5% حجم محيط كشت تازه) از محيط کشت تلقيح به آنها افزوده شد. براي هوادهي يكنواخت داخل هر ارلن مگنتي قرار داده شد. سپس ارلنها در داخل انکوباتور همزن دار56(Lovibond, Germany) با سرعت rpm 250 و با دماي C‍‍‍?30 قرار داده شدند. جهت درک روند تغييرات، به مدت 4 روز و هر 12 ساعت و در مجموع96 ساعت از محيط کشت نمونهگيري صورت گرفت. در هر نمونهگيري 6 ميليليتر از محيط کشت تحت شرايط کاملا استريل و در زير laminar flow برداشت شد. از اين مقدار 1 ميليليتر جهت سنجش دانسيته نوري57 مورد استفاده قرار گرفت. 5 ميليليتر باقيمانده از نمونه بالا به مدت 20 دقيقه و با سرعت rpm 3000، سانتريفيوژ (Hermel, Germany) گرديد. پس از سانتريفيوژ، مايع رويي58 جهت آناليز مقدار گلوکزو فروکتوز مورد استفاده قرار گرفت. سلول باقيمانده در انتهاي لوله نيز براي استخراج و سنجش نوع و ميزان پليمر توليدي استفاده گرديد.

2-8- تهيه منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي- جذب
150 ميليليتر از محيط كشت، در ارلن ml500 تهيه گرديد. پس از اتوكلاو تا هنگام سرد شدن به حال خود گذاشته شد. سپس كشت تلقيح59 بميزان 5% حجمي به محيط کشت افزوده شد و به مدت 18 ساعت در دماي محيط قرار گرفت تا به فاز رشد نمايي رسيد. حجمهاي مختلف 1، 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9 و 10 ميليليتر از باکتري رشد داده شده، در 10 سري لوله آزمايش ريخته شد و تمامي آنها با آب مقطر به حجم 10 ميليليتر رسانده شدند. ميزان جذب محلولهاي تهيه شده با دستگاه اسپكتروفتومتر و در طول موج nm620 اندازهگيري شد (از آب مقطر به عنوان شاهد در قرائت نمونه ها با اسپكتروفتومتر استفاده گرديد). در مرحله بعد، تعداد 10 عدد فيلتر 45/0 ميکرون را از 1 تا 10 شمارهگذاري گرديد و به مدت 16 ساعت در آون با دماي oC50 قرار داده شد. پس از سردشدن فيلترها، آنها را توزين نموده و 1 ميليليتر از هر يك از محلولهاي باکتري، با غلظتهاي مختلف از فيلترهاي خشکشده گذرانده شد و مجدداً به مدت 16 ساعت در داخل آون در دماي oC80 قرار گرفت. پس از خشکشدن و تعيين وزن ثانويه، وزن خشک سلولي60 (CDW) براي هر يک از غلظتها بدست آمد. منحني هاي كاليبراسيون ميزان جذب و وزن خشك سلولي در پيوست نشان داده شده است که در ا
دامه آزمايشات جهت محاسبه وزن خشک سلولي بکار گرفته شد.

2-9- تهيه منحنيهاي كاليبراسيون جهت تعيين مقادير منابع کربن
2-9-1- طرز تهيه محلول معرف DNS
هيدرواكسيد سديم 2 مولار (Merck) به عنوان محلول مادر61 براي تهيه محلول DNS مورد استفاده قرار گرفت. در ابتدا 20 گرم NaOH را در آب ديونيزه حل كرده و در بالن حجمي62 به حجم 250 ميليليتر رسانده شد. پس از سرد شدن 10 گرم، 3و5- دي نيترو ساليسيليك اسيد به 200 ميليليتر از سود 2 مولار اضافه گرديد. تركيب بدست آمده روي هيتر گذاشته شد و يك مگنت براي هم زدن محلول درون آن قرار داده شد تا نمك كاملاً حل شد. همزمان با اين كار 300 گرم، پتاسيم سديم تارتارات (Merck) را به طور جداگانه در200 ميليليتر آب ديونيزه ريخته و گرم کرديم تا کاملا حل شد. در نهايت هر دو محلول را در شرايطي که کاملا داغ بودند به يکديگر افزوده شدند. جهت جلوگيري از ايجاد رسوب، اين مرحله بدون تاخير انجام گرديد. پس از سرد شدن آن را داخل يك ارلن حجمي 1 ليتري ريخته و با آب ديونيزه به حجم رسانيده شد[101].
2-9-2- رسم منحني كاليبراسيون قندهاي قابل تبديل
براي رسم منحني کاليبراسيون هر يک از قندهاي قابل تبديل که شامل گلوکز و فروکتوز بودند، ابتدا محلولي با غلظت 1 گرم بر ليتر از گلوکز و فروکتوز بعنوان محلول مادر تهيه گرديد. غلظتهاي متفاوت1/0، 2/0، 3/0، 4/0، 5/0، 6/0، 7/0، 8/0، 9/0 گرم بر ليتر از رقيقسازي محلول مادر تهيه شدند. 1 ميليليتر از هر يک از غلظتهاي تهيه شده بالا را در 10 سري لوله آزمايش ريخته و به آنها 1 ميليليتر معرف DNS اضافه گرديد. به 1 ميليليتر آب مقطر، 1 ميليليتر از محلول DNS اضافه کرده و بعنوان شاهد در اندازهگيريها استفاده گرديد. لولههاي آزمايش محتوي نمونهها به مدت 10 دقيقه در حمام آب جوش قرار داده شدند و پس از اين مدت بلافاصله به حمام آب يخ (جهت توقف سريع واکنش) انتقال يافتند. پس از سردشدن، 8 ميليليتر آب مقطر به هر يك از آنها افزوده و ميزان جذب آنها با دستگاه اسپكتروفتومتر و در طول موج nm540 اندازهگيري شد[101]. منحني كاليبراسيون گلوکز ، فروکتوز و لاکتوز را برحسب ميزان غلظت قند و جذب نمونه درپيوست آمده است.

2-10- شرايط کروماتوگرافگازي براي اندازهگيري پليهيدروکسيآلکانواتها
براي اندازه گيري بيوپليمر پلي هيدروکسي آلکانوات از دستگاه گازکروماتوگراف (Philips PU4400, Enrpmland) مجهز به دتکتورFID63، نرم افزار (Claritylite 4.2, Data Apex, Czech Republic) و ستون (Capillary column, BP 20, SGE, Australia) با طول 25 متر و 25/0 ميليمتر قطر داخلي استفاده شد. دماي اوليه ستون 80 درجه سانتيگراد بود که بعد از 4 دقيقه دماي آون با سرعت °C/min 8 افزايش يافته تا به °C 160 رسيد و در اين دما به مدت 3 دقيقه باقي ماند و در نهايت با سرعت °C /min 30 اين دما به °C 200 افزايش يافت تا ستون تميز گردد. دماي محل تزريق و دتكتور به ترتيب C°250 و C°280 تنظيم شده بود. هليوم بعنوان گاز حامل با جريان ml/min2 استفاده شد. جريان گاز هيدروژن، نيتروژن و هوا بترتيب 30، 70 و ml/min300 بود ]34[.

2-10-1- تهيه استاندارد داخلي64
محلول متيل بنزوات بعنوان استاندارد داخلي جهت سنجش پليهيدروکسيآلکانوات و بميزان 10 ميکروليتر به هر نمونه به هنگام تزريق به GC استفاده شده بود. براي تهيه آن ابتدا، به 1/0 گرم اسيد بنزوات، 2 ميليليتر متانول اسيدي (3% اسيد سولفوريک) و 2 ميليليتر کلروفرم افزوده شد و محلول حاصل به مدت 5/3 ساعت در داخل آب در حال جوش (C°100) قرار گرفت. مراحل تهيه متيل استر اسيد بنزوات کاملا مشابه با مراحل آمادهسازي نمونههاي پليهيدروکسيآلکانواتها است[43].

2-10-2- تهيه منحنيهاي کاليبراسيون متيلهيدروکسيبوتيرات، متيل هيدروکسيوالرات و متيلهيدروکسيهگزانوات
براي اندازهگيري غلظت بر اساس مقايسه سطح زير منحني هاي کروماتوگرام، نمونه استانداردهاي متيل-3-هيدروکسي بوتيرات65 (Fluka)، متيل-3-هيدروکسي والرات66 (Fluka) و متيل-3-هيدروکسي هگزانوات67 (Aldrich) استفاده گرديد. در ابتدا محلوليppm 2000 از هرکدام ازاستانداردها به عنوان محلول مادر بصورت مخلوط تهيه شد. ساير غلظتهاي مورد نظر 100، 300، 600، 800 و 1000 ميليگرم در ليتر از رقيق سازي محلول مادر تهيه گرديد. به هر يک از محلولهاي استاندارد،?l/ml 10 از محلول متيل استر اسيد بنزوات اضافه شد. شکل 2-8 منحني کالييراسيون تهيهشده پس از تزريق نمونههاي استاندارد به دستگاه گازکروماتوگراف را نشان ميدهد. محور X غلظت نمونههاي استاندارد و محور Y نسبت سطح زير پيک نمونههاي استاندارد به سطح زير پيک استاندارد داخلي را نشان ميدهد. معادلات حاصل، جهت تعيين ميزان بيوپليمر توليدي در نمونههاي مجهول مورد استفاده قرار گرفتند. نمونه کروماتوگرام حاصل از تزريق نمونههاي استاندارد متيل-3-هيدروکسيبوتيرات، متيل-3-هيدروکسيوالرات و متيل-3-هيدروکسيهگزانوات، در پيوست آورده شده است.

2-10-3- استخراج بيوپليمر و آماده سازي نمونه براي تزريق به دستگاه GC
5 ميليليتر از محيط کشت در شرايط استريل به لولههاي سرپيچدار منتقل و در rpm 3000 به مدت 20 دقيقه سانتريفيوژ شد. مايع رويي تخليه و لوله محتوي ميکروارگانيسم در داخل آون قرار گرفت تا خشک شود. به بيوماس خشکشده 2 ميليليتر متانول اسيدي 3% و 2 ميليليتر کلروفرم اضافه گرديد. درب لولهها براي جلوگيري از خروج بخارات محکم بسته شد و به مدت 5/3 ساعت در دماي C ° 100 قرار گرفت. سپس لولهها خارج و پس از سردشدن 2 ميليليتر آب ديونيزه به آنها اضافه گرديد، افزودن آب جهت جداسازي اسيد و متانول اضافه از فاز آلي بوده است. لولهها پس از افزودن آب ديونيزه به مدت 5 دقيقه به شدت تک
ان داده شدند. بعد از حدود 60 دقيقه سه فاز تشکيل شد که به ترتيب و از بالا به پايين، شامل فاز آب و متانول، بقاياي اجزاي سلولي و در نهايت فاز آلي يا کلروفرم حاوي متيل استر هيدروکسيآلکانوات بود. بعد از جدا شدن کامل فازها ، 1 ميلي ليتر از مايع زيرين حاوي متيل استر برداشته و به ويالهاي شيشهاي سرپيچدار منتقل شد و با نوارهاي پارافيلم درب آنها براي جلوگيري از تبخير احتمالي محتويات داخل ويال بسته شد. نمونهها تا زمان تزريق به دستگاه گازکروماتوگراف در داخل فريزر و در دماي C° 20- نگهداري شدند ]41[.

2-10-4- روش شناسايي و تاييد بيوپليمر توسط 13C NMR،1H NMR ، FT-IR
2-10-4-1- طيف سنجي مادون قرمز (FT-IR)68
جهت انجام آزمون ابتدا 1 ميلي گرم از بيوپليمر استخراج شده با 300 ميلي گرم KBr (Merck) بصورت قرص نيمه شفاف در آورده شد. سپس طيف مادون قرمز با استفاده از دستگاه FT-IR (Shimadzu, FTIR 1650, Japan) ثبت گرديد.

2-10-4-2- طيف بيني رزونانس مغناطيسي هسته اي (NMR)69
طيف بيني رزونانس مغناطيسي هسته اي مهم ترين و پر کاربرد ترين تکنيکي است که براي تشخيص ساختار ترکيبات آلي و غير آلي استفاده مي شود. NMR تنها تکنيک طيف نمائي است که براي آن همه طيف يک ترکيب تحليل و تفسير مي شود واين تکنيک امروزه يک روش نيرومند و توسعه يافته براي مشخص کردن ساختمان مولکول هاي پيچيده است.
براي انجام اين آزمايش، بيوپليمر استخراج شده در کلروفرم دوتريوم دار حل شده و با استفاده از دستگاه NMR 400 مگاه هرتز (Bruker , DRX 400, Germany) آناليز شدند.

2-11- فرايند فرايند بيولوژيکي جهت توليد بيوپليمر درون سلولي در بيوراکتور
2-11-1- فرايند کشت غيرپيوسته
فرايند غيرپيوسته در يک بيوراکتور 4 ليتري (حجم کاري 8/3 ليتر) (New Brunswick Scientific, USA)
انجام شد.در ابتدا بيوراکتورحاوي محيط کشت، طبق جدول 2-1 ، در pH 7/6 – 2/7 توسط اضافه نمودن اسيد وباز ( اسيد کلريدريک 2 نرمال و سود سوزآور 2 نرمال) در دماي 30 درجه سانتيگراد و دور همزن 500 – 900 دور در دقيقه کاليبره شد.حجم اوليه محيط کشت 2 ليتر در نظر گرفته شد.سپس بيوراکتور در اتوکلاو در دماي 121 درجه سانتيگراد به مدت 20 دقيقه استريل شد. بعد از سرد شدن محيط کشت ،مقدار 5 درصد حجم اوليه از محيط پيش کشت به بيوراکتور تلقيح شد. ميزان توزيع اکسيژن لازم با استفاده از هواي استريل توسط توزيع کننده70 با سرعت 5/1-2 ليتر بر دقيقه بود. غلظت اکسيژن نامحلول در محيط کشت در اندازه 30 درصد اشباع به صورت دستي با کنترل سرعت هم زن تنظيم شد.
2-11-2- فرايندکشت نيمه پيوسته
در شرايط کاملا مشابه با فرايند کشت غير پيوسته ، فرايند کشت نيمه پيوسته با مقادير اوليه 40 گرم بر ليتر گلوکز و 1 گرم بر ليتر نيتروژن در حجم 2 ليتر راه اندازي شد . در ابتدا فرايند به صورت غير پيوسته ادامه يافت .سپس با توجه به شدت رشد سلولي، جرم سلولي توليد شده و ميزان اکسيژن نامحلول ،وقتي که ميزان منبع نيتروژن به نزديک صفر کاهش يافت، خوراک دهي منبع نيتروژن و کربن آغاز گشت.ميزان خوراک دهي از


دیدگاهتان را بنویسید