ناچار بایستی به شکل 1-فسفریک استر قبل از اینکه وارد چرخه گلوکز ایزومری تبدیل گردند.
D- گلوکز به سهولت بوسیله مخمر تجزیه گردیده و به الکل اتیلیک و دی‌اکسید کربن تبدیل میشود. همچنین این قند بوسیله باکتریها متابولیزه شده و موجب تشکیل انواع فراورده‌ها مانند هیدروژن ، اسیدهای استیک و بوتیریک ، الکل بوتیل ، استون و بسیاری از فراورده‌های دیگر می‌شود. در این تحقیق میزان کاهش گلوکز محیط کشت طی فرایند کشت بسته مورد بررسی قرار گرفته است.
گلوکز در سراسر غشای سلولی قادر به پخش بدون کمک از پروتئین های ناقل است و طی اکسایش تنفسی که منجر به تجزیه و اکسیداسیون و تبدیل آن به مولکولهای کوچکتر می شود تولید آب ، دی‌اکسید کربن و انرژی به شکل ATP می نماید. این فرایند طی سه مرحله انجام می‌گیرد. در مرحله گلیکولیز ، گلوکز 6 کربنی به دو مولکول سه کربنی تجزیه شده و مقدار کمی انرژی بوجود می‌آید. در مرحله دوم مولکولهای سه کربنی حاصل به نوبه خود در طی یک سری واکنشهای زیست شیمیایی دورانی موسوم به چرخه کربس یا اسید سیتریک به تدریج کربن خود را به صورت دی‌اکسید کربن از دست داده و هیدروژن آزاد می‌کنند.
در نهایت در مرحله نهایی تنفس الکترونی به توسط یک سری مواد ناقل الکترون که بر حسب پتانسیل رودکس زنجیره‌وار به دنبال هم قرار دارند، الکترون گرفته شده و سرانجام به اکسیژن منتقل می‌شوند و آب را تولید می‌کنند. در ضمن احیا و اکسید شدن مواد ناقل به دنبال هم انتقال الکترونها ، مقداری انرژی الکترونها رها می‌شود که برای فعال کردن پمپ های یونی (پروتونی) غشای درونی میتوکندری و در نهایت تولید ATP به مصرف می‌رسد.
شکل) 1-9)
در واقع، بازده گلوکز به لاکتات (YLac/ GLC) و گلوتامین به آمونیاک (YAmm/ Gln) در تمام محیط های ها تقریبا مشابه می باشد.
ویتامینها به عنوان کوفاکتور در واکنش های مختلف مربوط به متابولیسم اسید آمینه و عملکرد پروتئین مورد نیاز است.
در حالی که سایر مواد مغذی ضروری مانند املاح معدنی، اسیدهای آمینه و ویتامین ها و عوامل رشد، هورمون ها، وپروتئین های انتقال دهنده به مقدار کمتر مورد نیاز است که این ترکیبات معمولا با افزودن سرم جنین گاو (FBS) تامین می شود.
مقدار گلوکز در سلول فرمولاسیون محیط کشت از g/L1 به عنوان کمترین تا g/L10 به عنوان بالاترین میزان می باشد.
1-32)عناصر تشکیل دهنده محیط کشت
➢ در محیط های کشت ساخته شده مواد غذایی زیر وجود دارند:
1-عناصر ماکرو
2-عناصر میکرو
3-هیدرات های کربن یا قند ها
4-ویتامین ها
5-هورمون ها
6- اسید های آمینه همچون گلایسین و ترکیبات پیچیده مثل پپتون هیدرولیزات کازئین
1-32-1)عناصر ماکرو
➢ L-glutamine , Hypoxantine Thymidine)HT) جز ترکیباتی هستند که حاوی عناصر ماکرو هستند.موادی مانند Ca , MgSN P , K که به مقدار بیش از 5/0میلی مول بر لیتر ، مورد نیاز سلول می باشند در چنین ترکیباتی که به صورت استوک ساخته می شوند وجود دارد.
نقش عناصر ماکرو در محیط کشت
نیتروژن: در ساختمان پروتئین ها ، نوکلئوتید ها ، برخی کوانزیم ها وجود دارد.
فسفر: در ساختمان اسید های نوکلئیک ، ATP و مواد حد واسط فتوسنتز وتنفس وجود دارد.
پتاسیم: مهمترین کاتیون تنظیم کننده فشار اسمزی در سلول می باشد.
کلسیم: در بیوسنتز دیواره سلولی موثر است.
منیزیم: در ساختمان کلروفیل نقش دارد و به عنوان کوفاکتور عمل می کند.
گوگرد: در ساختمان اسید های آمینه مثل سیستئین و متیونین ( پیش ماده سنتز اتیلن ) نقش دارد و در ساختمان برخی کوانزیم ها دیده می شود.
1-32-2)عناصر میکرو
این مواد به مقداری کمتر از 5/0 میلی مول بر لیتر مورد نیاز گیاه می باشند.این عناصر شاملFe , Mn , Cu , B , Zn , Co , I , Mo می باشند.در میان این عناصر فقط آهن به صورت استوک جداگانه و بقیه عناصر به صورت یک استوک (استوک میکرو) ساخته می شود.
➢ معمولا استوک آهن درون فویل پیچیده می شود زیرا نور تجزیه کننده آهن است. محلول استوک نمک های میکرو همانند استوک نمک های ماکرو برای کوتاه مدت در یخچال قابل نگهداری است. و برای نگهداری طولانی مدت ، از فریزر استفاده می شود.
1-32-3)نقش عناصر میکرو در محیط کشت
مس: به عنوان کوفاکتور عمل می کند و در واکنش های زنجیره انتقال الکترون نقش دارد.
روی: در بیوسنتز کلروفیل و هورمون اکسین موثر است و به عنوان کوفاکتور نیز عمل می کند.
آهن : در زنجیره انتقال الکترون موثر است.
منگنز: به عنوان کوفاکتور عمل می کند.
مولیبدن: به عنوان کو فاکتور عمل می کند و در ساختمان برخی آنزیم ها دیده شده است.
کبالت : در ساختمان برخی ویتامین ها مثل B12 بکار رفته است.
ید: به دلیل سمیت ، کاربرد زیادی در کشت سلول ندارد.
بور: به عنوان کوفاکتور عمل می کند.
قندها یا هیدرات های کربن
به دلیل نور کم در محیط درون شیشه ای، فتوسنتز چندانی صورت نمی گیرد، لذا افزودن قند در محیط کشت کاملا ضروری است. معمولا از قند ساکاروز ، فروکتوز و گلوکز استفاده می شود.
1-32-4)ویتامین ها
اکثر ویتامین ها توسط سلول ساخته می شود؛ لیکن اضافه نمودن برخی از ویتامین هانظیر اسید نیکوتینیک(B3) ، تیامین (B1) ، پیرودوکسین (B6) و… به محیط کشت ضروری است. همچنین از ویتامینC به عنوان آنتی اکسیدان استفاده می شود. ویتامین ها معمولا به صورت استوک X 100 ( یعنی صد برابر) تهیه می شوند عموما ویتامین ها را توسط فیلتراسیون ، استریل می کنند و از اتوکلاو (به دلیل حساسیت ویتامین ها به گرما) استفاده نمی شود.
1-32-5) Pluronicacid
Pluronic یک ترکیب محلول در آب می باشد و بخشی از یک دسته مهم از سورفاکتانت های غیر یونی حاوی یک مرکز آبگریز polypropylene oxide (PPO) و دو دم آبدوست polyethylene oxide (PEO) است. سورفاکتانت-F68 Pluronic به طور گسترده ای در مقیاس های بزرگ کشت سلولی پستانداران استفاده می شود. این ترکیب سبب حفاظت سلول ها در محیط کشت از دو عامل نامطلوب می گردد.
• در بیوراکتورهای کشت سلول یکی ازدلایل مرگ سلول ها واکنش سلول های پستانداران با حباب های ایجاد شده در محیط کشت می باشد. Pluronicبا ایجاد حالتپایدار در این حباب ها مانع واکنش آنها با سلول و نهایتا مرگ آنها می گردد.
• با حفاظت سلول ها در برابر تنش های ناشی از تکان های ایجاد شده در انکوباتور سبب زنده ماندن آنها می شود.
1-33)نقش گلوتامین در محیط کشت
گلوتامین یک جزء مهم در برای سنتز پپتید، پروتئین ها، قندهای اسید های آمینه پورینی و پیریمیدینی در محیط کشت سلول های پستانداران به شمار می رود. همین امر سبب شده که اغلب به عنوان یک منبع انرژی جایگزین همراه با قند مورد استفاده قرار می گیرد.
همچنین به عنوان یک منبع انرژی مهم همراه با گلوکز محسوب می شود. با این حال، کاتابولیسم گلوتامین، می تواند منجر به تولید آمونیاک، که یک محصول جانبی سیتوتوکسیک تا حدود (g/L 6/0) در محیط کشت سلولی شود. مطالعات نشان داده که حتی تا(g/L 12/0)، آمونیاک تاثیر منفی بر روی رشد سلول و تولید پروتئین نوترکیب دارد.
برای غلبه بر اثرات سمی ناشی از آمونیاک در سلول، گلوتامات، و آسپاراژین و دی پپتیدهایی مانند L-alanyl-L-گلوتامین glycyl-L-گلوتامین به عنوان جایگزین استفاده می شود. با استفاده از تکنیک های electrokinetic و غشای آبگریز – بی حرکت و جاذب جهت حذف آمونیاک ازمحیط کشت نیز تلاش هایی انجام شده است .
مواد و روش ها
2-1)دستگاه های مورد نیاز
• هود بیولوژیک II)) شرکت بعثت
• شیکر انکوباتور کشت سلول شرکت N-biotek
• شیکر انکوباتور کشت میکروب شرکت Giotech
• انکوباتور معمولی °37 شرکت Memmert
• میکروسکوپ معکوس
• میکروسکوپ فلوسیتومتریک
• دستگاه اسپکتروفوتومتر شرکت Nano drop
• شیکر ELISA SHAKER) ELISA) شرکت Memmert
• واشر ELISA washer)ELISA)
• خواننده ELISA reader) ELISA)
• Heat Block شرکت Memmert
• Rotator شرکت ندای فن
• Vortex شرکت ندای فن
• اسپکترومتری- UV شرکت Uvitech
• سانتریفوژ یخچال دار شرکت eppendorf
• فریزر -70 شرکت eppendorf
• فریزر-20 شرکت فیلور
• اتوکلاو شرکت ابزار تجهیز
• بن ماری شرکت Bioneer
• pH متر
• ترازوی دیجیتال
• تانک ازت
2-2) میکروارگانیسم ها و سلول های مورد استفاده
• سلول (dhfr-) rCHO DG44 شرکت invitrogen
• پلاسمید Ptracer –SV40 حاوی ژن t-PA(truncated) ,GFP و مقاومت به Zeocin شرکت invitrogen
• باکتری E.coli Top10F’ شرکت Fermentas
2-3)لیست کامل مواد استفاده شده
• کشت سلول
• محیط کشت ProCHO 5 (Lonza, Verviers, Belgium)
• محیط کشت CD DG44(GIBCO Invitrogen USA)
• محیط کشت BRC(بخش بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران)
• محیط کشت Leuria Bertani Agar&Broth
• (HT)Hypoxanthine,Tymidine
• L-glutamine 200Mm(100X)(GIBCO)
• PLURONIC® F-68(10%)(GIBCO)
• FBS(Fetal Bovine Serum)+EDTA 10X
• انسولین انسانی
• پپتون های گیاهی Organotechnie France))
• آنتی بیوتیک100X Penstrep
• آنتی بیوتیک(USA Invitrogen) Zeocin
• سولفات مس 1%
• آب UHP
• اندازه گیری میزان بیان پروتئین نوترکیب
➢ کیت Trinity Biotech plc.Ireland)) Biopool Chromolize t-PA Assay
➢ SDS/polyacrylamide gel Bio-Rad, (CA, USA)
➢ HEPES
➢ EDTA شرکت Merck
➢ Glacial acetic acid
• TGE
➢ Poly ethileneimine) (PEI) (Polysciences, Eppelheim, Germany;
➢ PBS(Phosphate Buffer Solution)
➢ Nacl 150mM
• واکنش Transformation
• کشت لیوفیلیزه باکتری E.coli Top10F’
• محیط کشت Luria Bertani Agar (LB Agar) شرکت Merck
• محیط کشت Lurai Bertani Broth(LB Broth) شرکت Merck
• آنتی بیوتیک Ampicillin
• آنتی بیوتیک Tetracyclin
• Cacl2 شرکت Merck
• واکنش DNA Extraction
Giga ( Endofree plasmid Mega kit )
2-4) لیست کامل وسایل مورد استفاده
• سمپلر1-10
• سمپلر 10-100
• سمپلر100- 1000
• فالکون فیلتر دار بیوراکتور 50
• (PCV) تیوب
• پلیت کشت سلول
• انواع فلاسک کشت سلولی
• فیلتر سرنگیsyring filter
• کرایوتیوب cryo tube
• پيپت پاستور
• بطری شیشه ای(Schott Glass, Mainz, Germany)
• کرایوویال
• ميكرو تيوب 1.5 ml
• سر سمپلر زرد
• سر سمپلر آبی
• سر سمپلر كريستالي
• پلیت 6 خانه دربدار استریل
• پلیت 12 خانه دربدار استریل

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید