PCV% و نمونه برداری از محلول رویی حاصل از سانتریفوژ سلول ها طی محاسبه PCV برای اندازه گیری میزان بیان پروتئین توسط روش Elisa و همچنین اندازه گیری متابولیت های سلولی تولید شده و گلوکز مصرف شده توسط سلول ها انجام شد.
پپتون های مورد استفاده جهت بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب در جدول 2 ذکر شده است.
جدول(2-3)
درصد آمینواسید هر یک از پپتون های مورد لستفاده به صورت شماتیک در نمودار (2-1) نشان داده شده است.
نمودار (2-1)
خصوصیات فیزیکوشیمیایی و میکروبیولوژی هر یک از پپتون ها در جداول زیر نشان داده شده است.
جدول (2-4)
جدول(2-5)
جدول(2-6)
جدول)2-7)
جدول(2-8)
جدول( 2-9)
2-16-1) تعیین پروفایل رشد
روش (Packed Cell Volume) شکل (2-2) حجم سلول پک شده به کمک تیوبهای Valupac® و اندازه گیر مناسب پس از سانتریفوژ 1 دقیقه در g 2650صورت گرفت. PCV ، 175/0%معادل cell/ml 106×1 برای سلولهای CHO DG44 کشت داده شده در شرایط استاندارد می باشد.
شکل (2-3)
2-16-2)تعیین پروفایل بیان به روش Elisa
➢ پروتئین t-PA به دلیل داشتن فعالیت بیولوژیک طبیعی سبب فعال شدن پلاسمینوژن و تبدیل آن به پلاسمین می شود وپلاسمین حاصل نیز باعث تجزیه پیوند آمیدی در پلی پپتید ها می گردد که به این پدیده فعالیت آمیدولیتیک اطلاق می شود.به این ترتیب اندازه گیری فعالیت آمیدولیتیک به طور غیر مستقیم بیانگر فعالیت بیولوژیک طبیعی t-PA می باشد.به همین منظور جهت بررسی فعالیت آمیدولیتیک t-PA نوترکیب حاصل شده در محیط کشت سلول های rCHO DG44 ترانسفکت شده کیت اندازه گیری فعالیت t-PA خریداری شده از شرکت Biopool با حساسیت بالای اندازه گیری IU/ml5/0 در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفت. اساس این کیت بر پایه اتصال t-PA به آنتی بادی مونوکلونال 322SP- پوشانده شده در چاهکهای مخصوص می باشد. پس از طی مراحل پیشنهادی پروتکل این کیت , در حضور سوبسترای پلاسمینوژن و رنگزای 2251S، میزان جذب توسط دستگاه الایزا ریدر , شکل (14-2) در nm405 وnm402 انداز گیری گردید . میزان رنگ ایجادی متناسب با میزان فعالیت t-PA در نمونه هاست.
شکل(2-4)
مواد موجود در کیت و سایر مواد مورد استفاده
1)Lyophilized.8well strips coated with monoclonal antibody SP-322
2)PET buffer
Nacl
EDTA
Tween 20
Phosphate
3) t-PA activity standard :Lyophilized human plasma containing 2IU/ml human melanoma t-PA
4)Plasminogen reagent:Lyophilized plasminogen and FDP
5) Glacial acetic
6)HEPES buffer pH: 8.5
HEPES
Tween 20
0.2% Sodium azide
EDTA
7)Citrate buffer pH : 5.9
8)Substrate reagent:Lyophilized H-D-But-CHT-Lys-Pna and Poly D-Lysin
• تهیه بافر ها
➢ ساخت بافر ها و مراحل تست مطابق پروتکل شرکت سازنده کیت انجام شد.
➢ جهت رسم منحنی استاندارد µl500 آب مقطر دیونیزه به ویال t-PA استاندارد اضافه شد و min5 به آرامی مخلوط گردید.
مقادیر مختلف استاندارد t-PA و بافر سیترات مطابق جدول (2-2)به چاهک ها اضافه گردید.
Citrate buffer(µl)
(µl)
Concentration(IU/ml)
150
0
150
50
0.5
100
100
1.0
50
150
1.5
150
2.5
جدول(2-2)
➢ ml6 محلول HEPES buffer را به ویال پلاسمینوژن اضافه و min5 به آرامی مخلوط شد.
➢ ml6 محلول HEPES buffer را به ویال سوبسترا افزوده و min5 به آرامی مخلوط شد.
➢ محلول توقف واکنش(Stop Solution) از مخلوط نمودن ml1 اسید استیک گلاسیال به ml9 آب مقطر تهیه شد.اسید استیک حاصل M7/1 می باشد که جهت انجام هر تست باید به صورت تازه تهیه و مورد استفاده قرار گیرد.
روش کار
1)به هر یک از چاهک ها µl 100 از نمونه های t-PA استاندارد ( IU/ml2,5/1, 1, 5/0,0) اضافه شد.
2) µl100 از رقت 1:100 سوپرناتان محتویات هر یک از محیط های کشت سلول های ترانسفکت شده اضافه شد.
3)استریپ چاهک ها به مدت min3 در دمای اتاق و در rpm 600 shake شد.
4)محتویات استریپ چاهک ها خارج و با وارونه نمودن چاهک ها و با ایجاد چهار ضربه بر روی یک سطح جاذب کاملا حذف شد.
5)چاهک ها با محلول PET buffer چهار بار مطابق مرحله 4 شسته شدند.
6) µl 100 از سوبسترا و پلاسمینوژن به هر چاهک اضافه و استریپ ها را به مدت min80 در دمای اتاق روی شیکر rpm 600 قرار داده شد.
7) جهت توقف واکنش µl 100 ازمحلول Solution Stop به هر چاهک اضافه گردید و استریپ ها به مدت min1 روی شیکر rpm 600 قرار داده شد.
8) جذب نوری تست انجام شده در طول موج های nm405و nm403 خوانده شد.
2-16-2) بررسی تغییرات رفتار متابولیک سلول ها
استاندارد سازی و تعیین غلظت گلوکز
• ابتدا gr6 پودر گلوکز در ml10آب مقطر حل شد.سپس رقت های (1,1:10,1:100)تهیه شد.غلظت هر یک از رقت های تهیه شده با دستگاه NANODROP- 1000 خوانده شد.پس از رسم منحنی استاندارد و اندازه گیری غلظت گلوکز هر هر یک از نمونه ها نمودار های میزان غلظت گلوکز مربوط به هر یک از محیط های در شرایط مختلف تغذیه پپتونی اندازه گیری شد.
2-16-3)استاندارد سازی و تعیین غلظت آمونیوم
• غلظت هر یک از رقت های تهیه شده با دستگاه NANODROP- 1000 خوانده شد.پس از رسم منحنی استاندارد , غلظت آمونیوم هر یک از محیط های کشت در شرایط مختلف نغذیه پپتونی بر حسب mg/ml اندازه گیری شد.
2-16-4) استاندارد سازی و تعیین تعیین غلظت لاکتات
• برای اندازه گیری غلظت لاکتات منحنی استاندارد لاکتات با تهیه رقت های 001/0,01/0,1/0و 1 رسم شد. غلظت هر یک از رقت های تهیه شده با دستگاه NANODROP- 1000 خوانده شد.پس از رسم منحنی استاندارد ,غلظت لاکتات هر یک از محیط های کشت در شرایط مختلف تغذیه پپتونی , بر حسب mg/ml اندازه گیری شد.
نتایج
3-1)ترانسفکشن سلول های rCHO DG44 به روش TGE
3-1-1)بررسی میزان بهینه PEI جهت انجام TGE
غلظت های مختلفµg/ml) PEI 1و5/1,2 ,5/2,3,4 (نتایج بدست آمده میزان ترانسفکشن در غلظت های به کار رفته را به ترتیب ( 86/12 ,71/28, 66/8 ,11/2, 42/4 , 93/2% (نشان داد که بهترین غلظت PEI برای انجام TGE غلظت/ml gµ2 با میزان ترانسفکشن 71/28% می باشد.
نمودار(4-1)
نتایج فلوسایتومتری بررسی تاثیر غلظت های مختلف PEI بر میزان TGE در 6 نمودار زیر نشان داده شده است.
3-1-2)بررسی میزان بهینه دانسیته سلولی جهت انجام TGE
نتایج بدست آمده در دانسیته های سلولی(106× 4 , 106× 3 , 106× 2, 106×1,105×5 ,105×2 )به کار رفته میزان ترانسفکشن برای هر یک از غلظت ها به ترتیب (24/8,66/3,38/4,48/34,68/38و98/34 % ) تعیین شد که بهترین دانسیته سلولی برای TGE دانسیتهcell/ml 105×5 با میزان ترانسفکشن 68/38% می باشد.
نمودار( 4-2)
نمودار های فلوسایتومتری هر یک از بررسی های انجام شده به ترتیب زیر می باشد:
3-1-3)بررسی میزان بهینه DNAجهت انجام TGE
نتایج بدست آمده میزان ترانسفکشن در غلظت های( cell/ml106 µg/ 25/0 , 5/0 ,625/0 , 7/0 , 1 و 25/1 )به کار رفته به ترتیب(49/39, 6/ 52, 635/50 , 415/44 , 8/52 , 965/52 )می باشد.
نمودار ( 4-3)
3-2)تعیین الگوی رشد سلول های CH0 DG44 در محیط های کشت ProCHO 5,CD DG44و BRC
کلون CHO به طور یکسان در سه محیط کشت ProCHO 5,CD DG44و BRC با ترکیب شیمیایی متفاوت جهت بررسی الگوی رشد کشت داده شد.
همانطور که نتایج نشان می دهد بیشترین میزان دانسیته سلولی و رشد سلول در محیط ProCHO 5 به دست آمده است.همچنین نتایج بدست آمده تفاوت خاصی از نظر رشد سلول CHOدر میزان دانسیته سلولی و PCV را در محیط های کشت CD DG44و BRC را نشان نمی دهد.گرچه میزان این فاکتور ها در محیط CD DG44 کمی بیشتر بود.بیشترین دانسیته سلولی در روز 7 در یک دوره کشت 11 روزه بود که البته از روز 6 میزان سلول های زنده شروع به کاهش نمود.
در رابطه با سلول های CHO ترانسفکت نشده در سه محیط ProCHO 5,CD DG44و BRC با ترکیب شیمیایی مختلف همین مقایسه انجام شد که البته بیشترین دانسیته سلولی در روز 9 دیده شد در صورتیکه این کاهش در سلول های ترانسفکت شده در محیط ProCHO 5 در روز 7 مشاهده شد.
نمودار (3- a1)
شکل( 3- b1)
نمودار(3- a1) و نمودار( 3- b1) نشان دهنده میزان شمارش سلول , PCV و تعداد سلول های زنده کلون سلول های CH0 DG44 تولید کننده t-PA در محیط های ProCHO 5 CD DG44,وBRC می باشد.
3-3)غلظت پپتون ها وابسته به نوع محیط کشت
سلول های CHO تولید کننده t-PA در 3 محیط کشت ProCHO 5,CD DG44و BRC با ترکیب شیمیایی متفاوت کشت داده شدند.به هر یک از آنها غلظت g/L1 و g/L2 از پپتون های با منشا گیاهی اضافه شد.برای محیط ProCHO 5افزوده شدن پپتون سبب افزایش توده سلولی و PCV شد .در غلظت g/L1 پپتون از پپتون های 6,2 ,5,3 و 4سبب افزایش دانسیته سلولی شد.
مقدار PCV به طور مشخصی در هر دو غلظت از پپتون ها به جز پپتون 5 در غلظت g/L2 دیده شد.
در محیط ProCHO 5 افزودن پپتون سبب افزایش دانسیته سلولی می گردد.و تنها در حضور پپتون 1 با وجود افزایش میزان PCV دانسیته سلولی کاهش نشان داده است.در غلظت g/L1 از پپتون های6,5,2,4و3 به ترتیب به میزان 115,59,54,45و 20% افزایش در بیشترین مقدار دانسیته سلولی مشاهده شد. در غلظت g/L2 از پپتون برای پپتون های 6,2,5,4و3 به ترتیب 156,70,65,55و 18% افزایش در دانسیته سلولی تععین شد.میزان PCV برای همه پپتون ها به جز پپتون 5 که در غلظت g/L2 پپتون کاهش داشت در هر دو غلظت g/L1 و g/L2 پپتون افزایش واضحی را نشان داد.
نمودار (3-b2)
نمودار( 3- c2 (
نمودار (3- d2 )
شکل های (3-2) نشان دهنده تاثیر غلظت های g/L1 و g/L2 از پپتون ها بر دانسیته و PCV سلول های CHO تولید کننده t-PA کشت شده در محیط ProCHO 5 می باشد.شکل های aوb تعداد سلول های زنده و میزان PCV در غلظت g/L1 و شکل های cوd تعداد سلول های زنده و میزان PCV در غلظت g/L2 را نشان می دهند.
در محیط CD DG44 پس از افزودن غلظت g/L1 و g/L2 مقدار دانسیته سلولی و بیوپسی در پپتون های 1,2و 6 افزایش داشت.بیشترین افزایش دانسیته سلولی در پپتون 1 و پپتون های 2و 6 مشاهده شد.
مقدار PCV در غلظت g/L1 از پپتون 6 بیشترین مقدار در حدود 54% و پپتون 2 به اندازه 27% و پپتون 3 23% را نشان داد.
به همین ترتیب پروسه تغذیه با غلظت g/L2 پپتون سبب افزایش 72% و 63% و 21% درPCV محیط های حاوی پپتون های 2,6 و 1 شد.
نمودار( 3- a3)
نمودار( 3- b3 )
نمودار (3-c 3)
نمودار( 3- d3)
نمودار های (3-3)aوb تعداد سلول های زنده و میزان PCV در غلظت g/L1و نمودار های cوd نعداد سلول های زنده و میزان PCV در غلظت g/L 2 در محیط CD DG44 را نشان می دهند.
همین ترتیب پروسه تغذیه با غلظت g/L2 پپتون سبب افزایش 72% و 63% و 21% در PCV محیط های حاوی پپتون های 2,6 و 1 شد.شکل های(3-b3)و(3-d3)نشان دهنده تاثیر غلظت g/L1و g/L 2 از پپتون ها بر دانسیته سلولی و میزان PCV در سلول های CHO DG44 تولید کننده t-PA در محیط کشت

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید